RNA介导的基因沉默
丁香园
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1. 引言
转录后水平基因沉默（PTGS) ，又被称为 RNA 沉默，是指在植物中导入双链 RNA (dsRNA) 、外源基因或病毒而引起与之同源的植物基因下调表达。在 PTGS 过程中，目的基因能转录，但转录产物由于迅速被降解而不能积累 [1 , 2 ] 。RNA 干扰（RNAi ) 过程中 dsRNA 直接诱导与其同源的特异 mRNA 降解 [3~5 ] 。RNAi 的发现和对它的分子解析是现代科学史上最重要的技术突破之一。十几年前，在植物和真菌中，人们无意中发现 RNA 均能抑制蛋白质的表达，后来这种现象被分别定义为共抑制和基因压制 [ 6 , 7] 。共抑制是指外源基因与同源的内源基因表达同步降低。最初这些发现说明基本的机制发生于转录后水平，并具有序列特异性。1998年， Fire 和 Mello 以及他们的同事首次在秀刚新小杆线虫（ Caenorak iseZegarw ) 中发现，双链 RNA 是序列特异的 RNA 降解的原因[3 ]，这一发现实现了真正的理论突破。 2006 年，由于这个里程碑式的发现， Fire 和 Mello 被授予诺贝尔生理学或医学奖。后来的研究证明，dsRNA 也是植物 PTGS 和真菌基因压制的有效起始因子[8 , 9 ] 。不同实验室的类似实验都证实，dsRNA 是导致线虫、植物和真菌中的 RNA 沉默的触发因子，说明这是一种存在普遍的机制。几年后，研究证实 dsRNA 介导的基因沉默所需的基因也是相类似的（综述，见 [10] )。
含有目的基因的病毒载体可以通过病毒诱导的基因沉默（VIGS) 系统 [ 11 ] 引发植物的 PTGS，能够产生发夹转录物（hairpin RNA，hpRNA) [ 12 ] 的反向重复序列、反义 RNA 技术 [13]、基因过量表达（共抑制），都能在植物中引发 PTGS。进一步研究表明，在植物和无脊椎动物中，引发 RNAi 的作用元件是小分子的双链 RNA (smallinterfering RNA, siRNA) [4, 14, 15]，而它是在细胞质中由 Dicer 酶 [ 15] 降解 dsRNA 产生的。siRNA长度为 21~22 nt，其 3' 端含有 2 个游离未配对的核苷酸。Dicer 识别 dsRNA 并从两端将其切断，形成 siRNA。在植物和动物中， siRNA 介导的 RNA 沉默的途径有所不同。例如，在植物中，两种不同的短 siRNA ( 21~22 nt) 和长 siRNA ( 24~26 nt) 均可积累 [16]，而在动物中只有短 siRNA 积累 [4]。siRNA 通过序列互补性与 HNA 诱导的基因沉默复合物 [RISC] 结合，并切割内源 RNA 转录产物而引起基因沉默。siRNA 也负责放大沉默信号，它编码的内源 RNA 能通过植物基因组编码的 RNA 介导的 RNA 多聚酶（RdRP) [ 17, 18 ] 转化成 dsRNA。因此，几个 dsRNA 分子足以长期引发目的基因的沉默，并通过细胞分裂传播到植物未处理的细胞和组织中，且能稳定遗传。图 12. 1 以图表的形式对 RNAi 机制进行了总结。
与反义 RNA 介导的基因沉默和共抑制相比，RNAi 具有高效、稳定且筛选沉默植物所需时间更短等优点 [12]。RNAi 产生的沉默效果几乎与基因敲除一样彻底。反义抑制和共抑制的限速步骤可能是通过植物编码的 RdRP 合 成 dsRNA，而由 dsRNA 引发的 RNAi 直接绕过了 dsRNA 合成的步骤。当发生共抑制现象时，借由整合反向重复序列（复合整合模式）而产生 RNA 沉默的转基因植物，也能以通读方式从一个 T-DNA 拷贝转录到另一个 T- DNA 拷贝而产生 dsRNA。或者，与靶标 RNA 同源的反向重复序列转录所产生的外源基因，通过分子内的碱基配对产生 dsRNA，这比只用正义或反义 RNA 的基因沉默效果更好。目前，这一类产生自我互补转录产物的重组载体被广泛用于植物功能基因组研究[12 , 19 , 20]。RNAi 往往能稳定遗传，因此可以在后代中对其进行研究[21]。Stoutjesdijk 和 Travelle 等 [20，22 ] 分别在拟南芥和小麦中进行研究，结果表明用于 RNAi 的重组载体产生的表型变化能稳定遗传几代。因此，这种方法不仅为功能基因组学研究提供了可靠的工具，也为农作物目标性状的遗传改良提供了可靠的方法。例如，用 RNAi 研究 VRN2 和 VRN1，二者转录水平降低，分别是加速或推迟冬小麦的开花起始时间 [23 , 24]。与以突变为基础的反向遗传学方法相比，RNAi 的优点还表现在它能通过靶向基因中特异的或者共有的序列，沉默单基因、多基因、多基因家族中所有基因，或多倍体中的多基因拷贝[22 , 2 5, 26]。另外，与插入突变相比，RNAi 能通过使用特殊的启动子驱动 hpRNA 表达，而在特定组织中实现基因沉默。相应的，利用可诱导的 RNAi 系统灵活地控制基因失活的时间和程度，可以在植物发育的特殊阶段实现基因沉默，并且在不使用诱导子的情况下[27, 28 ] 使基因沉默得到恢复。
通过粒子轰击、农杆菌介导的渗透、病毒侵染等方式，禾谷类作物可以实现瞬时或稳定的 RNAi。有研究结果表明，用粒子轰击的方式将特异 dsRNA 导入大麦和小麦的单个表皮细胞中，能瞬时干扰基因的功能 [1，29, 30 ] 。 在禾谷类作物中，另一种有效沉默基因的方法是 VIGS [ 31 ] 。 这种方法采用改造的病毒侵染植物，病毒中含有的植物基因片段的转录产物能使目的基因瞬时失活[ 32~34 ] 。病毒 RNA 在自我复制中产生 dsRNA。由于可将转录产物直接侵染成株，VIGS 不仅在遗传转化费时的植物转化研究中特别有效，而且在植物看家基因、胚 发育（敲除导致胚致死的基因）关键基因的研究中也极其有用。通过简单的摩擦，即可将 VIGS 载体中可侵染的转录产物导入植物，因此 ，VIGS 同样适用于基因的高通量筛选。但利用 VIGS 做高通量筛选时，需要将每一个构建进行体外转录，这可能相当昂贵。在双子叶植物中，许多病毒被用作 VIGS 的载体[ 32, 35, 36 ] ， 而单子叶植物的 VIGS 只能利用大麦条纹花叶病毒 BSMV 作为载体，且只能用于大麦和小麦两种寄主植物[ 33, 34, 37 ] 。通过沉默八氢番茄红素脱氢酶 ( PDS ) 基因，VIGS 系统得到优化。PAS 基因沉默表型为叶片白化，这为 VIGS 沉默系统提供了一种便捷的、可见的报告因子。最近，在大麦中运用 VIGS 方法，证明了转录因子 HvWRKY1 和 HvWRKY2 是毒性白粉菌 （Biimeriagra graiini ) 诱导植物防卫反应的抑制因子 [ 38 ] 。不久前， Ding 等 [ 39 ] 克隆并改造了一种 VIGS 病毒，其来源于高羊茅 ( Festom arumfincea Schreb.) ( 无芒雀麦花叶病毒，BMV ), 在实验室接种大麦、水稻和玉米，产生系统花叶症状。另外，BMV 没有已知的昆虫介体，也不通过种子传播，增加了该系统的安全性。上述内容介绍了 RNAi 和 VIGS 在单细胞研究中的优点，若用于分析整个组织基因功能，或者研究植物中稳定遗传改变的试验，RNAi 诱导基因沉默系统仍然是首选的方法。
含有基因表达盒的 RNAi 和 VIGS 越来越多地应用于反向遗传学研究，作为研究方法的一部分用以鉴定基因功能。研究证明，在多种植物体系中，它们可有效地干扰基因表达，包括水稻 [26 ] 、大麦 [ 29 , 30 , 3；3 ] 和小麦 [ 22 , 34，40 ] 等禾谷类作物。在燕麦中，至今尚无 RNA 沉默的研究报道。RNAi 作为一种研究植物功能基因组的工具，确切地说，第一次大规模地使用是在拟南芥和玉米研究中，超过 100 个目的基因被沉默[41]。研究的关键一直集中在设计和构建可用的质粒载体，以便引发 RNAi 的外源基因能稳定地整合到染色体组中。本章将介绍目前在大麦和小麦中，下调基因表达所使用的 RNAi 和 VIGS 等多种方法。相对而言，虽然 RNA 基因沉默已是一项广泛应用的技术，但是，在植物研究中对其进行优化的报道相对较少。一段给定的序列能否产生 RNA 诱导目的基因的基因沉默，这其中有许多可能的因素参与作用。通常使用 “ 21bP 法则” [5,42 ]预测给定的反向序列 （IR) 是否会靶向目的基因，即 21 个核苷酸的 100% 同源足以引发基因沉默。Travella 等 [ 22 ] 证明在六倍体小麦中，RNAi 对三个同源基因有等量的沉默效果，这三个同源基因的编码区有 99% 的核苷酸同源性[43 ] 。 McGinnis 等的主要研究方向是玉米染色体中具有序列同源性的相关基因家族，他们最近的研究却表明 [ 41 ] , 即使目的基因与它们各自的 IR 序列有 90% 同源性，且至少有 3 个 21 bp 区域完全与 IR 同源，目的基因稳定状态的 RNA 含量并不降低。这一发现证明，序列同源性不是决定 IR 序列是否能诱导目的基因 mRNA 降解的唯一因素，其他因子也能起作用。需要做更多的试验，以明确哪一种特征特性可用于模拟和预测植物中给定反向重复序列的沉默效应。
2. 材料
2.1 RNA 干扰
2.1.1 发夹 RNA (hp- RNA) 载体的构建
( 1 ) 用聚合酶链反应（ PCR ) 扩增 300~600 bp 的目的基因，所使用的正向引物在 5' 端添加 BamH Ⅰ酶切位点，反向引物在 5' 端添加 Bgl Ⅱ 酶切位点（当采用 PAHC17 载体时 [ 44 ] ) 。
( 2 ) 用 PCR 扩增 300~600 bp 的内含子序列，所使用的正向引物 5' 端添加 Bgl Ⅱ 酶切位点，反向引物 5' 端添加 BamH Ⅰ 酶切位点。内含子序列要被克隆到目的基因的正向与反向序列之间从而形成 hp-RNA 结构。添加的酶切位点保证克隆的方向性（见注 1) 。
( 3 ) PAHC17 载体 [44 ] ，含有玉米 ubi-I 启动子和胭脂碱合酶终止子 （nos）（引物上含有限制性酶切位点，如果使用其他载体如 pStarling 和 pStargate，请查看网址 http ://www. pi. csiro. au/RNAi/ vectors, htm)。
( 4 ) 克隆 PCR 产物的 pGEM-T 载体（Promega)
( 5 ) PCR 纯化试剂盒或柱子（ Promega 或其他公司）
( 6 ) DNA 模板（20 ng)
( 7 ) 引物（各 10 μmol/L )
( 8 ) dNTP 混合物（10 mmol/L)
( 9 ) DNA 聚合酶（Sigma) 及配套缓冲液
( 10 ) 合适的限制酶（购于 Promega、NEB 等公司）
( 11 ) 含有相应抗生素的 LB 培养基（液体和固体）
2.1.2 RNAi 转基因植物的产生
( 1 ) 选择合适的转化体系（ 粒子轰击或农杆菌转化）（ 见引言）。
( 2 ) hpRNA 质粒与另一个包含有选择标记的质粒共转化（见第 3 章）。
( 3 ) 转化植物的再生与选择参见本卷其他部分的描述（ 见第 5~11 章）。
( 4 ) 转基因植物的分子鉴定（见第 13、第 14 章） （ 见第四篇 “转基因植株的鉴定” ）。
2. 2 病毒诱导的基因沉默（VIGS )
2.2.1 BSMV 衍生载体的构建
( 1 ) 在大麦和小麦中进行基因沉默所使用的 VIGS 载体是基于 γRNA 的 BSMV 载体 [ 37 ] ( 见注 2 和图 12.2)。
( 2 ) 扩增 300~600 bp 目的基因序列的 PCR 引物要在正向和反向引物的 5' 端分别添加 Not I 和 Pac I 酶切位点。
( 3 ) 用 Not I 和 Pac I 酶切 PCR 产物并插入到 γbPDS4 [ 37 ] 中；含有 PDS（八氢番茄红素脱氢酶）基因的载体同样用 Not I 和 Pac I 酶切。
2. 2.2 病毒 RNA 体外转录
使用 mMessage mMachine T7 体外转录试剂盒（Ambion) 合成体外转录产物，并按照产品说明书制备包含有三元 BSMV 基因组的三个线性质粒（用 MluI 消化 pBSMVa，用 Spe I 消化 pBSMVβ，用 BssH Ⅱ 消化含有与目的基因同源的片段的 pBSMVγb ) 。
2.3 实时定量 PCR
( 1 ) 使用 TRIzol 试剂（ Invitrogen Life Technology) 提取叶片或其他组织材料的总 RNA。遵守 RNA 提取常规规范，避免核糖核酸酶污染（ 见注3 ) 。
( 2 ) 取 10 μg 总 RNA 进行反转录。
( 3 ) 加入 Oligo (dT)21 引物 0.07 μg。
( 4 ) 反转录酶 （ 7 U) ( Invitrogen Life Technologies， Basel， Switzerland ) 及 1x 配套缓冲液
( 5 ) dNTP ( 每个反应 0.7 mmol/L )
( 6 ) dTT ( 10 mmol/L ) 及 1.5 U 的 RNase 清除剂（ Invitrogen Life Technologies, Basel, Switzerland)
2.4 小干扰 RNA 检测
( 1 ) 用含有 0.5 mol/L 氯化钠的 10% 聚乙二醇 8000 [ 14 ] 沉淀大分子质量 RNA ( 见注4 ) ，回收上清中的小分子质量 RNA。
( 2 ) 真空干燥 7 μg 小分子质量 RNA 碎片，干燥产物重悬于 10 μl 上样缓冲液（95% 甲酰胺、20 mmol/L EDTA pH 8.0、0.05% 溴酚蓝、0.05% 二甲苯氰）。
( 3 ) 将 RNA 样品在 95℃ 加热 5 min，冰上预冷后可上样。
( 4 ) 将 RNA 样品进行电泳检测。凝胶包含 15% 聚丙烯酰胺、7 mol/L 尿素、1xTBE，pH 8.5。20 cm 凝胶使用的电泳参数为 260 V/47 mA ( 见注5 ) 。
( 5 ) 用电印迹的方法将胶转移到 Hybond-N+ 膜（Amersham Biosciences) 上，使用 25 mmol/L 磷酸钠缓冲液，pH 6.5，15 V/200 mA 电转过夜。用紫外线（1200~2400 μJ ) 交联尼龙膜。
( 6 ) 在杂交时，可以使用 Arnbion 的 ULTRAhyb-Oligo 缓冲液（17x 缓冲液）。使用前需在 68℃ 环境中进行溶解。
( 7 ) 用 0.5 U T4 多核苷酸激酶（PNK，Roche) 和 6 μl [γ-32P ] ATP ( 5000 Ci/mmol ) 标记 1 μmol/L DNA 寡核苷酸（约含有 10 个与目的基因互补的 DNA 寡核苷酸）。
( 8 ) 参照 Hamilton 和 Baulcombe 的方法，在 35°C 条件下进行 RNA 印迹杂交[14]。
3. 注释
注 1 : 在细菌中通过“空白”区域将自我互补的区域隔开，获得稳定的反向重复序列。如果间隔序列编码内含子，基因沉默效率会非常高，确保由目的基因构建的转化子可以 100% 地引起不同程度的基因沉默[12]。
注 2 : BSMV 是大麦病毒家族的典型成员，它是正义单链 RNA 病毒，由 α、β 和 γRNA 组成三元基因组。选择植物中需要被沉默的目的基因的转录序列片段插入到 DNA 质粒中，可以通过体外转录合成 γRNA。植物 cDNA片段被克隆到 γb 可读框终止子的下游（图 12.2)。
注 3 : 在一般情况下，制备的 RNA 越纯（即无蛋白质、碳水化合物等），RNA 电泳的效果越好。
注 4 : 如果 RNA 浓度足够高，会立即产生肉眼可见沉淀；否则，将样品冰浴 30 min 也可以促进 RNA 沉淀。用 50% 甲酰胺溶液代替水配制 10% PEG/ 0.5 mol/L 氯化钠溶液更有助于 RNA 沉淀。
注 5 : 溴酚蓝恰好到达凝胶底部前停止电泳。此时 siRNA 跑到凝胶下部 2/3 或 3/4 处。
注 6 : 最近，一些商业化的 siRNA 供应公司（如 Dharmacon、Qiagen、Proligo、Ambion 和 Invitrogen 公司），以及一些学术机构（如 Cold Spring Harbor 和 Whitehead Institude ) ， 相继开发了专门的 siRNA 搜索程序。读者可以通过他们的网站访问这些程序。
注 7 : 每个 RNAi 结构包含一个目的基因的 cDNA 片段，但是在 5' 和 3' 端的正义和反义方向不同，由选择的内含子隔开（图 12.3)。
注 8 : 在转基因植株中观察到的沉默程度是多样化的，包括功能降低或功能缺失，这对于发现新基因和进行功能基因组学研究可能是一个有用的特征。完全沉默编码基本细胞功能的重要基因或细胞特殊发育阶段的关键基因可能导致植物死亡，而这些基因的降低表达可能引起可见的植物表型，揭示目的基因的作用。
注 9 : 与大麦相比，小麦中的白化表型通常表现为条纹状而不是整张叶片都白化 [34]。
注 10 : 与大麦相比，BSMV: 00 对照病毒在小麦中引起的相关症状较轻。不同基因型的大麦对 BSMV 侵染的感病性不同，然而不同品系的小麦一致地易于 BSMV-VIGS 侵染。
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转录后水平基因沉默（PTGS) ，又被称为 RNA 沉默，是指在植物中导入双链 RNA (dsRNA) 、外源基因或病毒而引起与之同源的植物基因下调表达。在 PTGS 过程中，目的基因能转录，但转录产物由于迅速被降解而不能积累 [1 , 2 ] 。RNA 干扰（RNAi ) 过程中 dsRNA 直接诱导与其同源的特异 mRNA 降解 [3~5 ] 。RNAi 的发现和对它的分子解析是现代科学史上最重要的技术突破之一。十几年前，在植物和真菌中，人们无意中发现 RNA 均能抑制蛋白质的表达，后来这种现象被分别定义为共抑制和基因压制 [ 6 , 7] 。共抑制是指外源基因与同源的内源基因表达同步降低。最初这些发现说明基本的机制发生于转录后水平，并具有序列特异性。1998年， Fire 和 Mello 以及他们的同事首次在秀刚新小杆线虫（ Caenorak iseZegarw ) 中发现，双链 RNA 是序列特异的 RNA 降解的原因[3 ]，这一发现实现了真正的理论突破。 2006 年，由于这个里程碑式的发现， Fire 和 Mello 被授予诺贝尔生理学或医学奖。后来的研究证明，dsRNA 也是植物 PTGS 和真菌基因压制的有效起始因子[8 , 9 ] 。不同实验室的类似实验都证实，dsRNA 是导致线虫、植物和真菌中的 RNA 沉默的触发因子，说明这是一种存在普遍的机制。几年后，研究证实 dsRNA 介导的基因沉默所需的基因也是相类似的（综述，见 [10] )。
含有目的基因的病毒载体可以通过病毒诱导的基因沉默（VIGS) 系统 [ 11 ] 引发植物的 PTGS，能够产生发夹转录物（hairpin RNA，hpRNA) [ 12 ] 的反向重复序列、反义 RNA 技术 [13]、基因过量表达（共抑制），都能在植物中引发 PTGS。进一步研究表明，在植物和无脊椎动物中，引发 RNAi 的作用元件是小分子的双链 RNA (smallinterfering RNA, siRNA) [4, 14, 15]，而它是在细胞质中由 Dicer 酶 [ 15] 降解 dsRNA 产生的。siRNA长度为 21~22 nt，其 3' 端含有 2 个游离未配对的核苷酸。Dicer 识别 dsRNA 并从两端将其切断，形成 siRNA。在植物和动物中， siRNA 介导的 RNA 沉默的途径有所不同。例如，在植物中，两种不同的短 siRNA ( 21~22 nt) 和长 siRNA ( 24~26 nt) 均可积累 [16]，而在动物中只有短 siRNA 积累 [4]。siRNA 通过序列互补性与 HNA 诱导的基因沉默复合物 [RISC] 结合，并切割内源 RNA 转录产物而引起基因沉默。siRNA 也负责放大沉默信号，它编码的内源 RNA 能通过植物基因组编码的 RNA 介导的 RNA 多聚酶（RdRP) [ 17, 18 ] 转化成 dsRNA。因此，几个 dsRNA 分子足以长期引发目的基因的沉默，并通过细胞分裂传播到植物未处理的细胞和组织中，且能稳定遗传。图 12. 1 以图表的形式对 RNAi 机制进行了总结。
与反义 RNA 介导的基因沉默和共抑制相比，RNAi 具有高效、稳定且筛选沉默植物所需时间更短等优点 [12]。RNAi 产生的沉默效果几乎与基因敲除一样彻底。反义抑制和共抑制的限速步骤可能是通过植物编码的 RdRP 合 成 dsRNA，而由 dsRNA 引发的 RNAi 直接绕过了 dsRNA 合成的步骤。当发生共抑制现象时，借由整合反向重复序列（复合整合模式）而产生 RNA 沉默的转基因植物，也能以通读方式从一个 T-DNA 拷贝转录到另一个 T- DNA 拷贝而产生 dsRNA。或者，与靶标 RNA 同源的反向重复序列转录所产生的外源基因，通过分子内的碱基配对产生 dsRNA，这比只用正义或反义 RNA 的基因沉默效果更好。目前，这一类产生自我互补转录产物的重组载体被广泛用于植物功能基因组研究[12 , 19 , 20]。RNAi 往往能稳定遗传，因此可以在后代中对其进行研究[21]。Stoutjesdijk 和 Travelle 等 [20，22 ] 分别在拟南芥和小麦中进行研究，结果表明用于 RNAi 的重组载体产生的表型变化能稳定遗传几代。因此，这种方法不仅为功能基因组学研究提供了可靠的工具，也为农作物目标性状的遗传改良提供了可靠的方法。例如，用 RNAi 研究 VRN2 和 VRN1，二者转录水平降低，分别是加速或推迟冬小麦的开花起始时间 [23 , 24]。与以突变为基础的反向遗传学方法相比，RNAi 的优点还表现在它能通过靶向基因中特异的或者共有的序列，沉默单基因、多基因、多基因家族中所有基因，或多倍体中的多基因拷贝[22 , 2 5, 26]。另外，与插入突变相比，RNAi 能通过使用特殊的启动子驱动 hpRNA 表达，而在特定组织中实现基因沉默。相应的，利用可诱导的 RNAi 系统灵活地控制基因失活的时间和程度，可以在植物发育的特殊阶段实现基因沉默，并且在不使用诱导子的情况下[27, 28 ] 使基因沉默得到恢复。
通过粒子轰击、农杆菌介导的渗透、病毒侵染等方式，禾谷类作物可以实现瞬时或稳定的 RNAi。有研究结果表明，用粒子轰击的方式将特异 dsRNA 导入大麦和小麦的单个表皮细胞中，能瞬时干扰基因的功能 [1，29, 30 ] 。 在禾谷类作物中，另一种有效沉默基因的方法是 VIGS [ 31 ] 。 这种方法采用改造的病毒侵染植物，病毒中含有的植物基因片段的转录产物能使目的基因瞬时失活[ 32~34 ] 。病毒 RNA 在自我复制中产生 dsRNA。由于可将转录产物直接侵染成株，VIGS 不仅在遗传转化费时的植物转化研究中特别有效，而且在植物看家基因、胚 发育（敲除导致胚致死的基因）关键基因的研究中也极其有用。通过简单的摩擦，即可将 VIGS 载体中可侵染的转录产物导入植物，因此 ，VIGS 同样适用于基因的高通量筛选。但利用 VIGS 做高通量筛选时，需要将每一个构建进行体外转录，这可能相当昂贵。在双子叶植物中，许多病毒被用作 VIGS 的载体[ 32, 35, 36 ] ， 而单子叶植物的 VIGS 只能利用大麦条纹花叶病毒 BSMV 作为载体，且只能用于大麦和小麦两种寄主植物[ 33, 34, 37 ] 。通过沉默八氢番茄红素脱氢酶 ( PDS ) 基因，VIGS 系统得到优化。PAS 基因沉默表型为叶片白化，这为 VIGS 沉默系统提供了一种便捷的、可见的报告因子。最近，在大麦中运用 VIGS 方法，证明了转录因子 HvWRKY1 和 HvWRKY2 是毒性白粉菌 （Biimeriagra graiini ) 诱导植物防卫反应的抑制因子 [ 38 ] 。不久前， Ding 等 [ 39 ] 克隆并改造了一种 VIGS 病毒，其来源于高羊茅 ( Festom arumfincea Schreb.) ( 无芒雀麦花叶病毒，BMV ), 在实验室接种大麦、水稻和玉米，产生系统花叶症状。另外，BMV 没有已知的昆虫介体，也不通过种子传播，增加了该系统的安全性。上述内容介绍了 RNAi 和 VIGS 在单细胞研究中的优点，若用于分析整个组织基因功能，或者研究植物中稳定遗传改变的试验，RNAi 诱导基因沉默系统仍然是首选的方法。
含有基因表达盒的 RNAi 和 VIGS 越来越多地应用于反向遗传学研究，作为研究方法的一部分用以鉴定基因功能。研究证明，在多种植物体系中，它们可有效地干扰基因表达，包括水稻 [26 ] 、大麦 [ 29 , 30 , 3；3 ] 和小麦 [ 22 , 34，40 ] 等禾谷类作物。在燕麦中，至今尚无 RNA 沉默的研究报道。RNAi 作为一种研究植物功能基因组的工具，确切地说，第一次大规模地使用是在拟南芥和玉米研究中，超过 100 个目的基因被沉默[41]。研究的关键一直集中在设计和构建可用的质粒载体，以便引发 RNAi 的外源基因能稳定地整合到染色体组中。本章将介绍目前在大麦和小麦中，下调基因表达所使用的 RNAi 和 VIGS 等多种方法。相对而言，虽然 RNA 基因沉默已是一项广泛应用的技术，但是，在植物研究中对其进行优化的报道相对较少。一段给定的序列能否产生 RNA 诱导目的基因的基因沉默，这其中有许多可能的因素参与作用。通常使用 “ 21bP 法则” [5,42 ]预测给定的反向序列 （IR) 是否会靶向目的基因，即 21 个核苷酸的 100% 同源足以引发基因沉默。Travella 等 [ 22 ] 证明在六倍体小麦中，RNAi 对三个同源基因有等量的沉默效果，这三个同源基因的编码区有 99% 的核苷酸同源性[43 ] 。 McGinnis 等的主要研究方向是玉米染色体中具有序列同源性的相关基因家族，他们最近的研究却表明 [ 41 ] , 即使目的基因与它们各自的 IR 序列有 90% 同源性，且至少有 3 个 21 bp 区域完全与 IR 同源，目的基因稳定状态的 RNA 含量并不降低。这一发现证明，序列同源性不是决定 IR 序列是否能诱导目的基因 mRNA 降解的唯一因素，其他因子也能起作用。需要做更多的试验，以明确哪一种特征特性可用于模拟和预测植物中给定反向重复序列的沉默效应。
2. 材料
2.1 RNA 干扰
2.1.1 发夹 RNA (hp- RNA) 载体的构建
( 1 ) 用聚合酶链反应（ PCR ) 扩增 300~600 bp 的目的基因，所使用的正向引物在 5' 端添加 BamH Ⅰ酶切位点，反向引物在 5' 端添加 Bgl Ⅱ 酶切位点（当采用 PAHC17 载体时 [ 44 ] ) 。
( 2 ) 用 PCR 扩增 300~600 bp 的内含子序列，所使用的正向引物 5' 端添加 Bgl Ⅱ 酶切位点，反向引物 5' 端添加 BamH Ⅰ 酶切位点。内含子序列要被克隆到目的基因的正向与反向序列之间从而形成 hp-RNA 结构。添加的酶切位点保证克隆的方向性（见注 1) 。
( 3 ) PAHC17 载体 [44 ] ，含有玉米 ubi-I 启动子和胭脂碱合酶终止子 （nos）（引物上含有限制性酶切位点，如果使用其他载体如 pStarling 和 pStargate，请查看网址 http ://www. pi. csiro. au/RNAi/ vectors, htm)。
( 4 ) 克隆 PCR 产物的 pGEM-T 载体（Promega)
( 5 ) PCR 纯化试剂盒或柱子（ Promega 或其他公司）
( 6 ) DNA 模板（20 ng)
( 7 ) 引物（各 10 μmol/L )
( 8 ) dNTP 混合物（10 mmol/L)
( 9 ) DNA 聚合酶（Sigma) 及配套缓冲液
( 10 ) 合适的限制酶（购于 Promega、NEB 等公司）
( 11 ) 含有相应抗生素的 LB 培养基（液体和固体）
2.1.2 RNAi 转基因植物的产生
( 1 ) 选择合适的转化体系（ 粒子轰击或农杆菌转化）（ 见引言）。
( 2 ) hpRNA 质粒与另一个包含有选择标记的质粒共转化（见第 3 章）。
( 3 ) 转化植物的再生与选择参见本卷其他部分的描述（ 见第 5~11 章）。
( 4 ) 转基因植物的分子鉴定（见第 13、第 14 章） （ 见第四篇 “转基因植株的鉴定” ）。
2. 2 病毒诱导的基因沉默（VIGS )
2.2.1 BSMV 衍生载体的构建
( 1 ) 在大麦和小麦中进行基因沉默所使用的 VIGS 载体是基于 γRNA 的 BSMV 载体 [ 37 ] ( 见注 2 和图 12.2)。
( 2 ) 扩增 300~600 bp 目的基因序列的 PCR 引物要在正向和反向引物的 5' 端分别添加 Not I 和 Pac I 酶切位点。
( 3 ) 用 Not I 和 Pac I 酶切 PCR 产物并插入到 γbPDS4 [ 37 ] 中；含有 PDS（八氢番茄红素脱氢酶）基因的载体同样用 Not I 和 Pac I 酶切。
2. 2.2 病毒 RNA 体外转录
使用 mMessage mMachine T7 体外转录试剂盒（Ambion) 合成体外转录产物，并按照产品说明书制备包含有三元 BSMV 基因组的三个线性质粒（用 MluI 消化 pBSMVa，用 Spe I 消化 pBSMVβ，用 BssH Ⅱ 消化含有与目的基因同源的片段的 pBSMVγb ) 。
2.3 实时定量 PCR
( 1 ) 使用 TRIzol 试剂（ Invitrogen Life Technology) 提取叶片或其他组织材料的总 RNA。遵守 RNA 提取常规规范，避免核糖核酸酶污染（ 见注3 ) 。
( 2 ) 取 10 μg 总 RNA 进行反转录。
( 3 ) 加入 Oligo (dT)21 引物 0.07 μg。
( 4 ) 反转录酶 （ 7 U) ( Invitrogen Life Technologies， Basel， Switzerland ) 及 1x 配套缓冲液
( 5 ) dNTP ( 每个反应 0.7 mmol/L )
( 6 ) dTT ( 10 mmol/L ) 及 1.5 U 的 RNase 清除剂（ Invitrogen Life Technologies, Basel, Switzerland)
2.4 小干扰 RNA 检测
( 1 ) 用含有 0.5 mol/L 氯化钠的 10% 聚乙二醇 8000 [ 14 ] 沉淀大分子质量 RNA ( 见注4 ) ，回收上清中的小分子质量 RNA。
( 2 ) 真空干燥 7 μg 小分子质量 RNA 碎片，干燥产物重悬于 10 μl 上样缓冲液（95% 甲酰胺、20 mmol/L EDTA pH 8.0、0.05% 溴酚蓝、0.05% 二甲苯氰）。
( 3 ) 将 RNA 样品在 95℃ 加热 5 min，冰上预冷后可上样。
( 4 ) 将 RNA 样品进行电泳检测。凝胶包含 15% 聚丙烯酰胺、7 mol/L 尿素、1xTBE，pH 8.5。20 cm 凝胶使用的电泳参数为 260 V/47 mA ( 见注5 ) 。
( 5 ) 用电印迹的方法将胶转移到 Hybond-N+ 膜（Amersham Biosciences) 上，使用 25 mmol/L 磷酸钠缓冲液，pH 6.5，15 V/200 mA 电转过夜。用紫外线（1200~2400 μJ ) 交联尼龙膜。
( 6 ) 在杂交时，可以使用 Arnbion 的 ULTRAhyb-Oligo 缓冲液（17x 缓冲液）。使用前需在 68℃ 环境中进行溶解。
( 7 ) 用 0.5 U T4 多核苷酸激酶（PNK，Roche) 和 6 μl [γ-32P ] ATP ( 5000 Ci/mmol ) 标记 1 μmol/L DNA 寡核苷酸（约含有 10 个与目的基因互补的 DNA 寡核苷酸）。
( 8 ) 参照 Hamilton 和 Baulcombe 的方法，在 35°C 条件下进行 RNA 印迹杂交[14]。
3. 注释
注 1 : 在细菌中通过“空白”区域将自我互补的区域隔开，获得稳定的反向重复序列。如果间隔序列编码内含子，基因沉默效率会非常高，确保由目的基因构建的转化子可以 100% 地引起不同程度的基因沉默[12]。
注 2 : BSMV 是大麦病毒家族的典型成员，它是正义单链 RNA 病毒，由 α、β 和 γRNA 组成三元基因组。选择植物中需要被沉默的目的基因的转录序列片段插入到 DNA 质粒中，可以通过体外转录合成 γRNA。植物 cDNA片段被克隆到 γb 可读框终止子的下游（图 12.2)。
注 3 : 在一般情况下，制备的 RNA 越纯（即无蛋白质、碳水化合物等），RNA 电泳的效果越好。
注 4 : 如果 RNA 浓度足够高，会立即产生肉眼可见沉淀；否则，将样品冰浴 30 min 也可以促进 RNA 沉淀。用 50% 甲酰胺溶液代替水配制 10% PEG/ 0.5 mol/L 氯化钠溶液更有助于 RNA 沉淀。
注 5 : 溴酚蓝恰好到达凝胶底部前停止电泳。此时 siRNA 跑到凝胶下部 2/3 或 3/4 处。
注 6 : 最近，一些商业化的 siRNA 供应公司（如 Dharmacon、Qiagen、Proligo、Ambion 和 Invitrogen 公司），以及一些学术机构（如 Cold Spring Harbor 和 Whitehead Institude ) ， 相继开发了专门的 siRNA 搜索程序。读者可以通过他们的网站访问这些程序。
注 7 : 每个 RNAi 结构包含一个目的基因的 cDNA 片段，但是在 5' 和 3' 端的正义和反义方向不同，由选择的内含子隔开（图 12.3)。
注 8 : 在转基因植株中观察到的沉默程度是多样化的，包括功能降低或功能缺失，这对于发现新基因和进行功能基因组学研究可能是一个有用的特征。完全沉默编码基本细胞功能的重要基因或细胞特殊发育阶段的关键基因可能导致植物死亡，而这些基因的降低表达可能引起可见的植物表型，揭示目的基因的作用。
注 9 : 与大麦相比，小麦中的白化表型通常表现为条纹状而不是整张叶片都白化 [34]。
注 10 : 与大麦相比，BSMV: 00 对照病毒在小麦中引起的相关症状较轻。不同基因型的大麦对 BSMV 侵染的感病性不同，然而不同品系的小麦一致地易于 BSMV-VIGS 侵染。
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