荧光原位杂交技术检测植物基因组中整合的转基因片段
丁香园
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1. 引言
分子细胞遗传学是研究染色质及染色体特性和分析染色体或间期细胞核上 DNA 序列的物理组织结构的一门科学。随着非放射性杂交和荧光显微镜技术的发展，多色分析已成为可能，并将极大地促进染色体研究工作。
荧光染色体分带技术中 [ 1 ] [ 图 14 . 1 ( a ) ] ，荧光染料均一或特异性地直接结合于碱基对和染色体 DNA 的某些片段上，以区分不同类型的异染色质，解读染色体上 DNA 序列的部分信息 [3]。由于未螯合的染料基本上是不发荧光的，染料与 DNA 结合后 ，其荧光性能会急剧增强，即使体积微小的和那些被原生质体及细胞壁包裹着的染色体也可以分析。荧光原位杂交技术（FISH ) 采用标记探针与染色体和细胞核进行原位性杂交 [ 4 ] [ 图 14. 1 ( b ) ] ，可将染色体组织结构的细胞生物学信息直接地与 DNA 序列的分子信息相结合[ 5, 6 ] ，因而能得到更多的信息。FISH 技术可用于定位基因组中 DNA 序列的物理位点，将连锁群关联到特定染色体，提供染色体或染色体片段标记来鉴定染色体以及检测染色体重组现象。
在植物分子生物学研究中， FISH 技术已被证实是非常有应用价值的，尤其对基因组和染色体的整体组织结构研究、了解染色体的重复序列区段特征特点及其多样性和进化历程等 [ 2, 9~12]。使用染色体 FISH 技术可以获得许多其他方法难以得到的结果，
电泳技术可以展现出重复序列一条或多条限制性酶切条带；但此法很难确定序列的位点，测序技术无法获得那些序列长且有一定同源性的重复序列的信息。PISH 技术还无需遗传分离分析，对于那些不育的作物，或树木等生长周期较长的物种，遗传分离的方法是很难进行的。FISH 技术和其他分子细胞遗传学方法、染色质组织分析及染色体模型构建等技术的兴起，对研究基因组结构、分析分裂间期和减数分裂期 DNA 序列的三维空间分布等大有帮助 [13 , 14]。在哺乳动物尤其是人类研究中，当运用单拷贝原位杂交技术定位单基因的物理位点，源源不断地补充遗传学信息时，在植物研究中，它仍然被看成是一项专业技术[15, 16]。在植物研究中，已定位的特征明显的单拷贝序列最短可短至 800 bp，但是 2.5 kb 或更长序列相对更易操作，为了物理定位，超过 40 kb 的目标序列需要与携带目标位点染色体的两个染色单体进行可靠的杂交；否则，只有统计分析几个细胞间期的结果，才能识别杂交探针的位点。检测和鉴定转基因的染色体位点 [17~20 , 30 ]，或整合到寄主基因组的病毒序列[21~23 ] , 其情况是极其独特的，因此，需要付出更多的努力去调整 FISH 技术，以分析低拷贝或单拷贝序列，其原因如下。
首先，通过 Southern 杂交或 PCR 方法，确切地验证某一外源 DNA 分子是否已经整合到基因组中是非常困难的，有时甚至是不可能做的；第二，采用图位法定位染色体上的转基因，需要对每个转基因系都建立一个分离群体； 第三，携带转基因或病毒序列的载体一般是几 kb 长，如果串联整合，为 FISH 实验提供了一个相对较小的但却可以使用的目标序列。越来越多的实验已经证明，转基因在基因组中的位置会对其表达水平和稳定性产生重要的影响，因此，了解片段插入位置很重要[ 23 ] , 而开展转基因系染色体分析的一个更进一步的理由是，需要明确转基因系的染色体是否保持完整，是否出现非整倍体、多倍体、染色体重组。
染色体原位杂交最初是使用放射性标记的卫星 DNA [ 24, 25]。现在，原位杂交几乎完全使用基于荧光技术的非放射性方法，这使得探针的定位更准确，且可同时使用几种探针 [4]。迄今为止，生物素和地高辛是 FISH 中最广泛使用的非直接性标记，其可用荧光标记的亲和素（或衍生物）或者抗体进行检测。另一种方法是使用荧光直接标记核苷酸，此法无需特殊的检测步骤，因而更加快捷且清晰，灵敏度却较间接标记法低一些。双靶标 FISH 技术是我们实验室的常用的方法，其使用红色和绿色荧光作为检测探针、DAPI 作为蓝色荧光复染染色体。而使用蓝光、远红外或者中间型荧光的三靶标或四靶标杂交技术，更多的是在人及哺乳动物细胞遗传学中应用。配比标记探针，一种探针包含一种以上标记（在探针标记的反应时或者反应后混合各个探针），不论在动物 [26 , 27 ] 还是植物[ 28 ] 系统中，都可以结合单标记探针使用，从而提高检测目标的数目。
本章介绍的染色体制备及染色方法，可用于遗传转化后的染色体完整性及多倍性检测，也可用于 FISH 实验。本章对探针准备和标记进行了一些讨论，最后介绍了 FISH 技术检测转基因的步骤及拍照和结果分析。
2. 材料
2.1 材料固定
( 1 ) 有丝分裂中期截获剂，任选以下几种之一：
( a ) 冰水（尤其适用于温带植物幼苗）：淡水或瓶装水装满一个 5~15 ml 的试管的 2/3 ( 见注 1 )；剧烈摇晃至出现气泡，置于 -20°C 直至水开始结冰，再振荡，然后保存于冰箱。
( b ) 8-羟基喹啉（适用于许多物种）：制备浓度为 2 mmol/L 的水溶液（淡黄色，需 12 h 溶解）；可 4℃ 黑暗保存 6 个月。
( c ) 秋水仙素（适用于多数植物）：制备 0.05%~1% (m/V) 的水溶液。可 4℃ 黑暗保存 1 个月。
( 2 ) 固定剂：新鲜制备（不超过 30 min) 。三份 96% 乙醇加一份冰醋酸。
( 3 ) 5~10 ml 小管，管塞子要紧。
2 . 2 染色体制备
( 1 ) 酶解缓冲液：制备 10x pH 4.6 的储存液，混合 4 份 100 mmol/L 柠檬酸和 6 份柠檬酸三钠。使用前用水稀释 10 倍。
( 2 ) 酶解液：2% (m/V ) 源自 Aspergius iger 的纤维素酶（Calbiochem，21947，4000 U/g），或者由 1.8% 的 Calbiochem 纤维素酶、0.2% 的 “ Onozuka” RS 纤维素酶 ( 5000 U/g ) 及 3% ( V/V ) 源自 Aspergius iger 的果胶酶（使用 40% 的甘油配制，Sigma P4716，450 units/ml) 共同组成的混合物。使用 1x 酶解缓冲液配制。每管分装成 2~5 ml，-20℃ 保存（见注 2) 。
( 3 ) 乙酸：10~20 ml 45% ( V/V）和 60% ( V/V) 乙酸水溶液。
( 4 ) 载玻片：玻片浸润于 80% ( V/V ) 三氧化铬的硫酸溶液中至少 3 h，蒸馏水洗涤，风干，用前用 96% 的乙醇擦拭（见注 3) 。
( 5 ) 玻璃盖玻片：18 mm x 18 mm 规格，No. 1 (见注4 )
( 6 ) 解剖针及镊子（ 如 5 号）。
( 7 ) 干冰或液氮。
2.3 探针标记
( 1 ) 标记试剂盒：基于随机引物法或者缺口前移法（如 Invitrogen 和 Roche 公司产品）。
( 2 ) 标记好的核苷酸（如果试剂盒中未提供）：Roche 公司地高辛的 d-UTP 或者 Amersham/GE Healthcare 及 Molecular Probes 公司的突光偶联 d-UTP 或 CTP。
( 3 ) 去除未标记核苷酸、酶液及盐离子的纯化管（如果试剂盒未提供，见注5) 。
2.4 玻片样品预处理
( 1 ) 2X SSC：20X 储存液稀释（20X 配方为：3 mol/L NaCl，0.3 mol/L 柠檬酸钠，pH 7) 。
( 2 ) RNA 酶液：用 10 mmol/L Tris-HCl 配制，浓度 10 mg/ml，pH 8，分装为 0.5~1 ml，-20℃ 保存。使用前用 2X SSC 稀释到 100 μg/ml。
( 3 ) 10 mmol/L HCl。
( 4 ) 胃蛋白酶溶液（可参考注 6)：10 mmoI/L HCl 配制浓度 500 μg/ml ( 大约 4000 U/mg) 的储存液，0.5~1 ml分装， -20°C 保存，使用前稀释到 1~10 μg/ml。
( 5 ) 乙醇梯度溶液：用水配制成 96%、80%~90% (V/V) 及70% ( V/V) 。
( 6 ) 多聚甲醛：在通风橱中，80 ml 水中加入 4 g 多聚甲醛（电镜级），60°C 加热 10 min，滴加 10 mol/L 氢氧化钠帮助溶解，冷却至 30℃ 后使用，用 1 mol/L H2SO4 将 pH 调至 8 。
( 7 ) 塑料盖玻片：40 mm x 25 mm 规格的玻片，取自可局压灭菌的塑料袋。
( 8 ) 能容纳 8 张玻片和 50~100 ml 溶液的染色缸。
2.5 杂交混样，变性和杂交
( 1 ) 甲酰胺：分装为 0.5~1 ml，-20℃ 保存（注 7) 。
( 2 ) 葡聚糖硫酸酯：50% (m/V ) 水溶液，加热溶解，0.22 μm 孔径滤膜过滤除菌；0.5~1 ml 分装，-20℃ 保存。
( 3 ) SDS 溶液：10% (m/V) 十二烷基硫酸钠（ 也称月桂醇硫酸酷钠盐）水溶液，过滤除菌，室温保存。
( 4 ) 鲑鱼精 DNA：1 μg/μl 超声波或高压处理的 DNA ( 也可用緋鱼精或者大肠杆菌 DNA) ; 0.5~1 ml 分装，-20℃ 保存。
( 5 ) 20X SSC 溶液：3 mol/L NaCl，0.3 mol/L 柠檬酸钠，调节 pH 至 7，如未经高压灭菌，使用 0.22 μm 孔径滤膜过滤除菌，0.5~1 ml 分装，-20°C 保存。
( 6 ) EDTA：100 mmol/L，pH 8；0.5~1 ml 分装，-20°C 保存。
( 7 ) 塑料盖玻片：25 mm X 25 mm 规格的玻片，取自可高压灭菌的塑料袋。
2.6 严谨洗涤及探针检测
( 1 ) 2X SSC 及 0.1X SSC：使用 20X 储存液体（ 见 2.4 节） ；每次准备 500 ml 并预热至 45℃。
( 2 ) 甲酰胺：40 ml 分装，-20℃ ( 见注 7) 。
( 3 ) 严谨性洗涤液：准备 100 ml 洗涤液，高严谨度洗涤液使用 20% 甲酰胺，0.1X SSC，低严谨度洗涤液为 20% 甲酰胺，2x SSC ( 见注 8) 。
( 4 ) 检测缓冲液：4X SSC 中加入 0.2% ( V/V）Tween-20，准备 500 ml 并预热到 45℃。
( 5 ) BSA 封闭液：检测缓冲液中加入 5% ( m/V）牛血清白蛋白。
( 6 ) 检测剂：每个玻片制备 50 μl 检测剂（见注 9 ) 。如果检测两个标记，则将两种试剂混合一并加入检测缓冲液。
( a ) 地高辛标记：抗地高辛（FAB- 片段）偶联荧光素（Roche) ; —般稀释度为 1 : 200 ( 见注 10);
( b ) 生物素标记：avidin、streptavidin、extra-avidin 或 antibiotin 偶联相应的荧光素 ( 如 Vector、 Sigma、 Molecular Probes 或 Roche) ; —般稀释度为 1 : 200~500 ( 见注 10 )。
( 7 ) 塑料盖玻片：25 mm X 40 mm 规格的玻片，取自可高压灭菌的塑料袋。
( 8 ) 染色缸，用于玻片洗涤，能至少容纳 100 ml 溶液。
2.7 复染和封片
( 1 ) DAPI 染液：制备 0.1 mg/ml 的 2 ’，6- diamidino-2 -phenylindle 水溶液，-20℃；保存，使用 Mcllvaine 缓冲液（18 ml 100 mmol/L 柠檬酸及 82 ml 200 mmol/L Na2HPO4，pH 调节为 7 ) 稀释到 2~4 μg/ml，分装成每管1 ml，-20℃ 保存。
( 2 ) 抗衰减剂：市场有售，如 Citifluor AF1 ( Agar)、 Vectashiled( Vector)、 SlowFade ( Molecular Probes) 或者 Fluorguard (Sigma) 。
( 3 ) 玻璃盖玻片：24 mm x 30 mm 或者 40 mm No.0 ( 见注4 ) 。
3. 注释
注 1 : 水质对于种子萌发和冰水处理非常重要。氯处理水、氨处理水或者管道里的重金属都会降低有丝分裂中期相的比率，因此建议使用瓶装水。
注 2 : 对不同的样品，向酶解液中添加如果胶酶（ 0.1% ~ 1% 溶液）或者复合多糖酶（0.1%~0.5% 溶液），或者改变酶解液中不同酶的配比，可能会获得更理想的效果。
注 3 : 高质量的玻片对于清晰的制片是很关键的。强酸处理玻片不仅可以去除油脂 ，还能去除玻片表面的阴离子，使细胞核和染色体黏附到玻片上。可以将洗过的玻片在相差显微镜下观察，帮助进一步去除表面杂质。如果没有铬酸，可用 6 mol/L HCl 清洗。也可以使用经过特殊表面处理的玻片，但有的可能会提高背景值，有的价格较昂贵。
注 4 : 好的样品常常散落在盖玻片周边，因此推荐使用小号盖玻片（18 mm x 18 mm ) 制样（2 . 2 节和3 . 2节），用大号盖玻片 （ 如 24 mm x 30 mm 或 40 mm ) 封片（ 2.7 节和 3.7 节 ) 。
注 5 :乙酸钠或者氯化锂进行乙醇沉淀的方法可以用来代替柱子纯化。
注 6 : 如果制品干净并且每个染色体都能相互区分开，这一步可以省略。调整样品浓度。
注 7 : 甲酰胺的等级要高，但不必用最高等级的。为防止试剂在敞开玻瓶中降解，在 -20°C 保存前，可将杂交混合液分装为每管 1 ml ( 第 2.5 节和第 3.5 节），洗涤液分装为每管 40 ml ( 第 2.6 节和第 3.6 节）。如果分装物不能完全冰冻，说明不纯净，应使用其他级别的甲酰胺或者调换批号。
注 8 : 对于低拷贝转基因，建议降低杂交严谨度，同时注意交叉杂交错配问题。
注 9 : 在光照（能量会损失荧光分子）下，大多数荧光衰减非常迅速。在制备溶液和操作玻片时都要避光。
注 10 : 抗体的稀释度变化很大，即使是同一厂商的不同批次试剂也一样。抗体浓度在使用时必须优化。通常的稀释度从 1 : 50~1 : 600。
注 11 : 玻璃器皿、植物材料取样工具或者环境（ 如冰箱）中空气的痕量固定剂将会降低细胞的有丝分裂中期相比率。不要使固定剂或固定剂蒸气交叉污染其他植物材料。
注 12 : 种子萌发新根后，如果这些种子不再用于播种，最好将整粒种子用冰处理和固定。
注 13 : 固定好的材料，只要不受热，可以保存数周到数月再进行染色体制备。但即使冷藏时，材料也会变硬，去除细胞质将变得困难。当 FISH 不久就要在实验室或者远程实验室开展时，储藏或寄送做好的染色体片子（ 3. 2 节）常常是更好的选择。
注 14 : 确保所有染色体 DNA 已被变性是非常重要的一步。但是处理时间过长或温度过高，又会改变染色体的形态。许多 PCR 仪经改造后能放置玻片 [29]，这对于精确的控制玻片温度和反应时间非常有好处。另外可取的方法包括使用恒温加热盘或者将玻片置于水浴锅盘中，这两种情况必须在样品旁放置温度计来精确地控制玻片温度。有一些实验操作是单独变性材料，先将玻片浸在 70% 甲酰胺和 2x SSC 的混合液中，60~80℃ 放置 6~10 min，之后再加入杂交混合液并盖上盖玻片。
注 15 : 如需长时间的保存或运输，可以用树脂或者指甲油将玻片封好。如果荧光变得非常微弱，尤其是经过长时间保存后，可去掉盖玻片，将玻片在检测缓冲液中简单洗涤并重新封片（有时有必要用 DAPI 重新染色）。
注 16 : 注意，有些转基因可能只出现在两条同源染色体的某一个上，或者整合到几个位点中。
参考文献
1. Schweizer， D. ( 1981) Counterstain-enhanced chromosome banding. Human Genet, 57, 1-14.
2. Content。， A . ， Heslop-Harrison, J. S. and Schwarzacher, T. (2005) Diversity of a major repetitive DNA sequence in diploid and polyploid Triticeae. Cytogenet Genome Res. 109, 3 4-42.
3. Kowalska, A., Bozsaky, E ., Ramsauer T ., Rieder, D ., Bindea G, Lorch T, Trajanoski Z. and Ambros P.F. (2007) A new platform linking chromosomal and sequence information Chromosome Res. 15, 327-339.
4. Schwarzacher T. and Heslop-Harrison J. S. (2000) Practical in situ Hybridization. Bios, Oxford, 213 + xii.
5. Schwarzacher, T. (2003) DNA, chromosomes, and in situ hybridization. Genome 4 6, 953-962.
6. Kato, A., Vega, J. M ., Han, F, Lamb, J. C. and Birchler, J. A. (2005) Advances in plant chromosomeidentification and cytogenetic techniques. Curr. Opin. Plant Biol. 8, 148-154.
7. Hasterok, R ., Marasek, A., Donnison, I. S ., Armstread, t . , Thomas, A., King, I. P ., Wolny, E ., Idzi-ak, D ., Draper, J. and Jenkins, G. (2006) Alignment of the genomes of Brachypodium distachyon and temperate cereals and grasses using BAC landing with fluorescent in situ hybridization. Genetics 173, 3 49-362.
8. Forsstrm, P. 0 ., Merker, A. and Schwarzacher, T. (2002) Characterization of mildew resistant wheat-ryesubstitution lines and identification of an inverted chromosome by fluorescent in situ hybridization. Heredity88, 349-355.
9. Heslop-Harrison J. S. (2 0 0 0 ). Comparative genome organization in plants ： from sequence and markers tochromatin and chromosomes. Plant Cell 12, 617-635.
10. Brandes, A., Thompson, H ., Dean, C. and Heslop-Harrison, J. S. (1997) Multiple, repetitive DNA sequences in the paracentromeric regions of Arabidopsis thaliana L. Chromosome Res. 5, 238-2 46.
11. Dechyeva, D ., Gindullis, F. and Schmidt, T. (2003) Divergence of satellite DNA and interspersion of dispersed repeats in the genome of the wild beet Beta procumbens. Chromosome Res. 11, 3-21.
12. Lim, K. Y ., Kovarik, A., Matyasek, R ., Chase, M. W ., Knapp, S ., McCarthy, E ., Clarkson, J. J. and Leitch, A. R. (2006) Comparative genomics and repetitive sequence divergence in the species of diploidNicotiana section Alatae. Plant J. 4 8, 907-919.
13. Schwarzacher, T. ( 1997) Three stages of meiotic homologous chromosome pairing in wheat ： cognition,alignment and synapsis. Sexual Plant Reprod. 10, 324-331.
14. Weierich, C ., Brero, A., Stein, S ., von Hase, J . , Cremer, C ., Cremer, T. and Solovei, I. (2003 )Three-dimensional arrangements of centromeres and telomeres in nuclei of human DNA murine lymphocutes.Chromosome Res. 11, 485-502.
15. Desel, C., Jung, C ., Cai, D. G ., Kleine, M. and Schmidt, T. (2001) High-resoltion mapping of YACsand the single-copy gene Hslpro-l on Beta vulgaris chromosome by multi-colour flurosecence in situ hybridization. Plant Mol. Biol. 4 5, 113-1 22.
16. Fransz, P. F, Stam, M ., Montijn, B ., Ten Hoopen, R ., Wiegant, J . , Kooter, J. M ., Oud, 0. and Nan-niga, N. ( 1996) Detection of single-copy genes and chromosome rearrangements in Petunia hybrida by fluorescence in situ hybridization. Plant J. 9 , 767-774.
17. Pedersen, C ., Zimny, J . , Becker, D ., Jhne-Grtner, A. and Lrz, H. (1997) Localization of introducedgenes on the chromosomes of transgenic barley, wheat and triticale by fluorescence in situ hybridization.Theor. AppL Genet. 9 4 , 7 49-757.
18. Leggett, J. M ., Perret, S. J . , Harper, J. and Morris, P. (2 0 0 0 ) Chromosomal localization ofcotransformed transgenes in the hexaploid cultivated oat Avena sativaL. using fluorescence in situ hybridization. Heredity 8 4 , 46-53.
19. Salvo-Garrido, H ., Travella, S ., Schwarzacher, T, Harwood, W. A. and Snape, J. W. (2001 ) An efficient method for the physical mapping of transgenes in barley using in situ hybridization. Genome 44 ,104-110.
20. Salvo-Garrido, H ., Travella, S ., Bilham, L. J . , Harwood, W. A. and Snape, J. W. (200 4 ) The distribution of transgene insertion sites in barley determined by physical and genetic mapping. Genetics 167,1371-1379.
21. Harper G ., Osuji J. O ., Heslop-Hairison J. S. and Hull R. 1999. Integration of banana streak badnavirusinto the Musa genome ： molecular and cytogenetic evidence. Virology255, 207-213.
22. Richert-Pggeler, K. R ., Noreen, F, Schwarzacher, T, Harper, G. and Hohn, T. (2003) Induction of infectious Petunia vein clearing ( pararetro) virus from endogenous provirus in petunia. EMBO J. 22,4 836-4 8 4 5.
23. Staginnus, C . ，Gregor, F ，Mette, M. F ., Teo, C. H ., Borroto-Femandez, E. G ., Laimer da CamaraMachado, M ., Matzke, M. and Schwarzacher, T. (2007 ) Endogenous pararetroviral sequences in tomato(Solanum lycopersicum) and related species. BMC Plant Biol. 7, 2 4.
24. Gall, J. G. and Pardue, M. L. ( 1969) Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytologi-cal preparations. P. N. A. 5. USA 63, 378-383.
25. John, H. A., Bimstiel, M. L. and Jones, K. W. ( 1969) RNA-DNA hybrids at the cytological level. Nature223, 582-587.
26. Nederlof, P. M, van der Flier, S ., Wiegant, J . , Raap, A. K ., Tanke, H. J . , Ploem, J. S. and van derPloeg, M. (1990) Multiple fluorescence in situ hybridization. Cytometry 11, 126-131.
27. Muller S ., Neusser M. and Wienberg J. 2002. Towards unlimited colors for fluorescence in-situ hybridization(FISH) Chromosome Res. 10, 223-232.
28. Mukai Y ., Ankara Y. and Yamamoto M. 1993. Simultaneous discrimination of the three genomes in hexa-ploid wheat by multicolour fluorescence in situ hybridization using total genomic and highly repeated DNAprobes. Genome 36, 489-494 .
29. Heslop-Harrison, J. S ., Schwarzacher, T, Anamthawat-Jonsson, K ., Leitch, A. R ., Shi, M. and Leitch,I. J. (1991) In situ hybridization with automated chromosome denaturation. Technique 3, 109-115.
30. Kohli A ., Twyman R. M ., Abranches R ., Wegel E ., Stoger E. and Christou P. (2003) Trans-gene integration, organization and interaction in plants. Plant Mol. Biol. 52, 247-258.
分子细胞遗传学是研究染色质及染色体特性和分析染色体或间期细胞核上 DNA 序列的物理组织结构的一门科学。随着非放射性杂交和荧光显微镜技术的发展，多色分析已成为可能，并将极大地促进染色体研究工作。
荧光染色体分带技术中 [ 1 ] [ 图 14 . 1 ( a ) ] ，荧光染料均一或特异性地直接结合于碱基对和染色体 DNA 的某些片段上，以区分不同类型的异染色质，解读染色体上 DNA 序列的部分信息 [3]。由于未螯合的染料基本上是不发荧光的，染料与 DNA 结合后 ，其荧光性能会急剧增强，即使体积微小的和那些被原生质体及细胞壁包裹着的染色体也可以分析。荧光原位杂交技术（FISH ) 采用标记探针与染色体和细胞核进行原位性杂交 [ 4 ] [ 图 14. 1 ( b ) ] ，可将染色体组织结构的细胞生物学信息直接地与 DNA 序列的分子信息相结合[ 5, 6 ] ，因而能得到更多的信息。FISH 技术可用于定位基因组中 DNA 序列的物理位点，将连锁群关联到特定染色体，提供染色体或染色体片段标记来鉴定染色体以及检测染色体重组现象。
在植物分子生物学研究中， FISH 技术已被证实是非常有应用价值的，尤其对基因组和染色体的整体组织结构研究、了解染色体的重复序列区段特征特点及其多样性和进化历程等 [ 2, 9~12]。使用染色体 FISH 技术可以获得许多其他方法难以得到的结果，
电泳技术可以展现出重复序列一条或多条限制性酶切条带；但此法很难确定序列的位点，测序技术无法获得那些序列长且有一定同源性的重复序列的信息。PISH 技术还无需遗传分离分析，对于那些不育的作物，或树木等生长周期较长的物种，遗传分离的方法是很难进行的。FISH 技术和其他分子细胞遗传学方法、染色质组织分析及染色体模型构建等技术的兴起，对研究基因组结构、分析分裂间期和减数分裂期 DNA 序列的三维空间分布等大有帮助 [13 , 14]。在哺乳动物尤其是人类研究中，当运用单拷贝原位杂交技术定位单基因的物理位点，源源不断地补充遗传学信息时，在植物研究中，它仍然被看成是一项专业技术[15, 16]。在植物研究中，已定位的特征明显的单拷贝序列最短可短至 800 bp，但是 2.5 kb 或更长序列相对更易操作，为了物理定位，超过 40 kb 的目标序列需要与携带目标位点染色体的两个染色单体进行可靠的杂交；否则，只有统计分析几个细胞间期的结果，才能识别杂交探针的位点。检测和鉴定转基因的染色体位点 [17~20 , 30 ]，或整合到寄主基因组的病毒序列[21~23 ] , 其情况是极其独特的，因此，需要付出更多的努力去调整 FISH 技术，以分析低拷贝或单拷贝序列，其原因如下。
首先，通过 Southern 杂交或 PCR 方法，确切地验证某一外源 DNA 分子是否已经整合到基因组中是非常困难的，有时甚至是不可能做的；第二，采用图位法定位染色体上的转基因，需要对每个转基因系都建立一个分离群体； 第三，携带转基因或病毒序列的载体一般是几 kb 长，如果串联整合，为 FISH 实验提供了一个相对较小的但却可以使用的目标序列。越来越多的实验已经证明，转基因在基因组中的位置会对其表达水平和稳定性产生重要的影响，因此，了解片段插入位置很重要[ 23 ] , 而开展转基因系染色体分析的一个更进一步的理由是，需要明确转基因系的染色体是否保持完整，是否出现非整倍体、多倍体、染色体重组。
染色体原位杂交最初是使用放射性标记的卫星 DNA [ 24, 25]。现在，原位杂交几乎完全使用基于荧光技术的非放射性方法，这使得探针的定位更准确，且可同时使用几种探针 [4]。迄今为止，生物素和地高辛是 FISH 中最广泛使用的非直接性标记，其可用荧光标记的亲和素（或衍生物）或者抗体进行检测。另一种方法是使用荧光直接标记核苷酸，此法无需特殊的检测步骤，因而更加快捷且清晰，灵敏度却较间接标记法低一些。双靶标 FISH 技术是我们实验室的常用的方法，其使用红色和绿色荧光作为检测探针、DAPI 作为蓝色荧光复染染色体。而使用蓝光、远红外或者中间型荧光的三靶标或四靶标杂交技术，更多的是在人及哺乳动物细胞遗传学中应用。配比标记探针，一种探针包含一种以上标记（在探针标记的反应时或者反应后混合各个探针），不论在动物 [26 , 27 ] 还是植物[ 28 ] 系统中，都可以结合单标记探针使用，从而提高检测目标的数目。
本章介绍的染色体制备及染色方法，可用于遗传转化后的染色体完整性及多倍性检测，也可用于 FISH 实验。本章对探针准备和标记进行了一些讨论，最后介绍了 FISH 技术检测转基因的步骤及拍照和结果分析。
2. 材料
2.1 材料固定
( 1 ) 有丝分裂中期截获剂，任选以下几种之一：
( a ) 冰水（尤其适用于温带植物幼苗）：淡水或瓶装水装满一个 5~15 ml 的试管的 2/3 ( 见注 1 )；剧烈摇晃至出现气泡，置于 -20°C 直至水开始结冰，再振荡，然后保存于冰箱。
( b ) 8-羟基喹啉（适用于许多物种）：制备浓度为 2 mmol/L 的水溶液（淡黄色，需 12 h 溶解）；可 4℃ 黑暗保存 6 个月。
( c ) 秋水仙素（适用于多数植物）：制备 0.05%~1% (m/V) 的水溶液。可 4℃ 黑暗保存 1 个月。
( 2 ) 固定剂：新鲜制备（不超过 30 min) 。三份 96% 乙醇加一份冰醋酸。
( 3 ) 5~10 ml 小管，管塞子要紧。
2 . 2 染色体制备
( 1 ) 酶解缓冲液：制备 10x pH 4.6 的储存液，混合 4 份 100 mmol/L 柠檬酸和 6 份柠檬酸三钠。使用前用水稀释 10 倍。
( 2 ) 酶解液：2% (m/V ) 源自 Aspergius iger 的纤维素酶（Calbiochem，21947，4000 U/g），或者由 1.8% 的 Calbiochem 纤维素酶、0.2% 的 “ Onozuka” RS 纤维素酶 ( 5000 U/g ) 及 3% ( V/V ) 源自 Aspergius iger 的果胶酶（使用 40% 的甘油配制，Sigma P4716，450 units/ml) 共同组成的混合物。使用 1x 酶解缓冲液配制。每管分装成 2~5 ml，-20℃ 保存（见注 2) 。
( 3 ) 乙酸：10~20 ml 45% ( V/V）和 60% ( V/V) 乙酸水溶液。
( 4 ) 载玻片：玻片浸润于 80% ( V/V ) 三氧化铬的硫酸溶液中至少 3 h，蒸馏水洗涤，风干，用前用 96% 的乙醇擦拭（见注 3) 。
( 5 ) 玻璃盖玻片：18 mm x 18 mm 规格，No. 1 (见注4 )
( 6 ) 解剖针及镊子（ 如 5 号）。
( 7 ) 干冰或液氮。
2.3 探针标记
( 1 ) 标记试剂盒：基于随机引物法或者缺口前移法（如 Invitrogen 和 Roche 公司产品）。
( 2 ) 标记好的核苷酸（如果试剂盒中未提供）：Roche 公司地高辛的 d-UTP 或者 Amersham/GE Healthcare 及 Molecular Probes 公司的突光偶联 d-UTP 或 CTP。
( 3 ) 去除未标记核苷酸、酶液及盐离子的纯化管（如果试剂盒未提供，见注5) 。
2.4 玻片样品预处理
( 1 ) 2X SSC：20X 储存液稀释（20X 配方为：3 mol/L NaCl，0.3 mol/L 柠檬酸钠，pH 7) 。
( 2 ) RNA 酶液：用 10 mmol/L Tris-HCl 配制，浓度 10 mg/ml，pH 8，分装为 0.5~1 ml，-20℃ 保存。使用前用 2X SSC 稀释到 100 μg/ml。
( 3 ) 10 mmol/L HCl。
( 4 ) 胃蛋白酶溶液（可参考注 6)：10 mmoI/L HCl 配制浓度 500 μg/ml ( 大约 4000 U/mg) 的储存液，0.5~1 ml分装， -20°C 保存，使用前稀释到 1~10 μg/ml。
( 5 ) 乙醇梯度溶液：用水配制成 96%、80%~90% (V/V) 及70% ( V/V) 。
( 6 ) 多聚甲醛：在通风橱中，80 ml 水中加入 4 g 多聚甲醛（电镜级），60°C 加热 10 min，滴加 10 mol/L 氢氧化钠帮助溶解，冷却至 30℃ 后使用，用 1 mol/L H2SO4 将 pH 调至 8 。
( 7 ) 塑料盖玻片：40 mm x 25 mm 规格的玻片，取自可局压灭菌的塑料袋。
( 8 ) 能容纳 8 张玻片和 50~100 ml 溶液的染色缸。
2.5 杂交混样，变性和杂交
( 1 ) 甲酰胺：分装为 0.5~1 ml，-20℃ 保存（注 7) 。
( 2 ) 葡聚糖硫酸酯：50% (m/V ) 水溶液，加热溶解，0.22 μm 孔径滤膜过滤除菌；0.5~1 ml 分装，-20℃ 保存。
( 3 ) SDS 溶液：10% (m/V) 十二烷基硫酸钠（ 也称月桂醇硫酸酷钠盐）水溶液，过滤除菌，室温保存。
( 4 ) 鲑鱼精 DNA：1 μg/μl 超声波或高压处理的 DNA ( 也可用緋鱼精或者大肠杆菌 DNA) ; 0.5~1 ml 分装，-20℃ 保存。
( 5 ) 20X SSC 溶液：3 mol/L NaCl，0.3 mol/L 柠檬酸钠，调节 pH 至 7，如未经高压灭菌，使用 0.22 μm 孔径滤膜过滤除菌，0.5~1 ml 分装，-20°C 保存。
( 6 ) EDTA：100 mmol/L，pH 8；0.5~1 ml 分装，-20°C 保存。
( 7 ) 塑料盖玻片：25 mm X 25 mm 规格的玻片，取自可高压灭菌的塑料袋。
2.6 严谨洗涤及探针检测
( 1 ) 2X SSC 及 0.1X SSC：使用 20X 储存液体（ 见 2.4 节） ；每次准备 500 ml 并预热至 45℃。
( 2 ) 甲酰胺：40 ml 分装，-20℃ ( 见注 7) 。
( 3 ) 严谨性洗涤液：准备 100 ml 洗涤液，高严谨度洗涤液使用 20% 甲酰胺，0.1X SSC，低严谨度洗涤液为 20% 甲酰胺，2x SSC ( 见注 8) 。
( 4 ) 检测缓冲液：4X SSC 中加入 0.2% ( V/V）Tween-20，准备 500 ml 并预热到 45℃。
( 5 ) BSA 封闭液：检测缓冲液中加入 5% ( m/V）牛血清白蛋白。
( 6 ) 检测剂：每个玻片制备 50 μl 检测剂（见注 9 ) 。如果检测两个标记，则将两种试剂混合一并加入检测缓冲液。
( a ) 地高辛标记：抗地高辛（FAB- 片段）偶联荧光素（Roche) ; —般稀释度为 1 : 200 ( 见注 10);
( b ) 生物素标记：avidin、streptavidin、extra-avidin 或 antibiotin 偶联相应的荧光素 ( 如 Vector、 Sigma、 Molecular Probes 或 Roche) ; —般稀释度为 1 : 200~500 ( 见注 10 )。
( 7 ) 塑料盖玻片：25 mm X 40 mm 规格的玻片，取自可高压灭菌的塑料袋。
( 8 ) 染色缸，用于玻片洗涤，能至少容纳 100 ml 溶液。
2.7 复染和封片
( 1 ) DAPI 染液：制备 0.1 mg/ml 的 2 ’，6- diamidino-2 -phenylindle 水溶液，-20℃；保存，使用 Mcllvaine 缓冲液（18 ml 100 mmol/L 柠檬酸及 82 ml 200 mmol/L Na2HPO4，pH 调节为 7 ) 稀释到 2~4 μg/ml，分装成每管1 ml，-20℃ 保存。
( 2 ) 抗衰减剂：市场有售，如 Citifluor AF1 ( Agar)、 Vectashiled( Vector)、 SlowFade ( Molecular Probes) 或者 Fluorguard (Sigma) 。
( 3 ) 玻璃盖玻片：24 mm x 30 mm 或者 40 mm No.0 ( 见注4 ) 。
3. 注释
注 1 : 水质对于种子萌发和冰水处理非常重要。氯处理水、氨处理水或者管道里的重金属都会降低有丝分裂中期相的比率，因此建议使用瓶装水。
注 2 : 对不同的样品，向酶解液中添加如果胶酶（ 0.1% ~ 1% 溶液）或者复合多糖酶（0.1%~0.5% 溶液），或者改变酶解液中不同酶的配比，可能会获得更理想的效果。
注 3 : 高质量的玻片对于清晰的制片是很关键的。强酸处理玻片不仅可以去除油脂 ，还能去除玻片表面的阴离子，使细胞核和染色体黏附到玻片上。可以将洗过的玻片在相差显微镜下观察，帮助进一步去除表面杂质。如果没有铬酸，可用 6 mol/L HCl 清洗。也可以使用经过特殊表面处理的玻片，但有的可能会提高背景值，有的价格较昂贵。
注 4 : 好的样品常常散落在盖玻片周边，因此推荐使用小号盖玻片（18 mm x 18 mm ) 制样（2 . 2 节和3 . 2节），用大号盖玻片 （ 如 24 mm x 30 mm 或 40 mm ) 封片（ 2.7 节和 3.7 节 ) 。
注 5 :乙酸钠或者氯化锂进行乙醇沉淀的方法可以用来代替柱子纯化。
注 6 : 如果制品干净并且每个染色体都能相互区分开，这一步可以省略。调整样品浓度。
注 7 : 甲酰胺的等级要高，但不必用最高等级的。为防止试剂在敞开玻瓶中降解，在 -20°C 保存前，可将杂交混合液分装为每管 1 ml ( 第 2.5 节和第 3.5 节），洗涤液分装为每管 40 ml ( 第 2.6 节和第 3.6 节）。如果分装物不能完全冰冻，说明不纯净，应使用其他级别的甲酰胺或者调换批号。
注 8 : 对于低拷贝转基因，建议降低杂交严谨度，同时注意交叉杂交错配问题。
注 9 : 在光照（能量会损失荧光分子）下，大多数荧光衰减非常迅速。在制备溶液和操作玻片时都要避光。
注 10 : 抗体的稀释度变化很大，即使是同一厂商的不同批次试剂也一样。抗体浓度在使用时必须优化。通常的稀释度从 1 : 50~1 : 600。
注 11 : 玻璃器皿、植物材料取样工具或者环境（ 如冰箱）中空气的痕量固定剂将会降低细胞的有丝分裂中期相比率。不要使固定剂或固定剂蒸气交叉污染其他植物材料。
注 12 : 种子萌发新根后，如果这些种子不再用于播种，最好将整粒种子用冰处理和固定。
注 13 : 固定好的材料，只要不受热，可以保存数周到数月再进行染色体制备。但即使冷藏时，材料也会变硬，去除细胞质将变得困难。当 FISH 不久就要在实验室或者远程实验室开展时，储藏或寄送做好的染色体片子（ 3. 2 节）常常是更好的选择。
注 14 : 确保所有染色体 DNA 已被变性是非常重要的一步。但是处理时间过长或温度过高，又会改变染色体的形态。许多 PCR 仪经改造后能放置玻片 [29]，这对于精确的控制玻片温度和反应时间非常有好处。另外可取的方法包括使用恒温加热盘或者将玻片置于水浴锅盘中，这两种情况必须在样品旁放置温度计来精确地控制玻片温度。有一些实验操作是单独变性材料，先将玻片浸在 70% 甲酰胺和 2x SSC 的混合液中，60~80℃ 放置 6~10 min，之后再加入杂交混合液并盖上盖玻片。
注 15 : 如需长时间的保存或运输，可以用树脂或者指甲油将玻片封好。如果荧光变得非常微弱，尤其是经过长时间保存后，可去掉盖玻片，将玻片在检测缓冲液中简单洗涤并重新封片（有时有必要用 DAPI 重新染色）。
注 16 : 注意，有些转基因可能只出现在两条同源染色体的某一个上，或者整合到几个位点中。
参考文献
1. Schweizer， D. ( 1981) Counterstain-enhanced chromosome banding. Human Genet, 57, 1-14.
2. Content。， A . ， Heslop-Harrison, J. S. and Schwarzacher, T. (2005) Diversity of a major repetitive DNA sequence in diploid and polyploid Triticeae. Cytogenet Genome Res. 109, 3 4-42.
3. Kowalska, A., Bozsaky, E ., Ramsauer T ., Rieder, D ., Bindea G, Lorch T, Trajanoski Z. and Ambros P.F. (2007) A new platform linking chromosomal and sequence information Chromosome Res. 15, 327-339.
4. Schwarzacher T. and Heslop-Harrison J. S. (2000) Practical in situ Hybridization. Bios, Oxford, 213 + xii.
5. Schwarzacher, T. (2003) DNA, chromosomes, and in situ hybridization. Genome 4 6, 953-962.
6. Kato, A., Vega, J. M ., Han, F, Lamb, J. C. and Birchler, J. A. (2005) Advances in plant chromosomeidentification and cytogenetic techniques. Curr. Opin. Plant Biol. 8, 148-154.
7. Hasterok, R ., Marasek, A., Donnison, I. S ., Armstread, t . , Thomas, A., King, I. P ., Wolny, E ., Idzi-ak, D ., Draper, J. and Jenkins, G. (2006) Alignment of the genomes of Brachypodium distachyon and temperate cereals and grasses using BAC landing with fluorescent in situ hybridization. Genetics 173, 3 49-362.
8. Forsstrm, P. 0 ., Merker, A. and Schwarzacher, T. (2002) Characterization of mildew resistant wheat-ryesubstitution lines and identification of an inverted chromosome by fluorescent in situ hybridization. Heredity88, 349-355.
9. Heslop-Harrison J. S. (2 0 0 0 ). Comparative genome organization in plants ： from sequence and markers tochromatin and chromosomes. Plant Cell 12, 617-635.
10. Brandes, A., Thompson, H ., Dean, C. and Heslop-Harrison, J. S. (1997) Multiple, repetitive DNA sequences in the paracentromeric regions of Arabidopsis thaliana L. Chromosome Res. 5, 238-2 46.
11. Dechyeva, D ., Gindullis, F. and Schmidt, T. (2003) Divergence of satellite DNA and interspersion of dispersed repeats in the genome of the wild beet Beta procumbens. Chromosome Res. 11, 3-21.
12. Lim, K. Y ., Kovarik, A., Matyasek, R ., Chase, M. W ., Knapp, S ., McCarthy, E ., Clarkson, J. J. and Leitch, A. R. (2006) Comparative genomics and repetitive sequence divergence in the species of diploidNicotiana section Alatae. Plant J. 4 8, 907-919.
13. Schwarzacher, T. ( 1997) Three stages of meiotic homologous chromosome pairing in wheat ： cognition,alignment and synapsis. Sexual Plant Reprod. 10, 324-331.
14. Weierich, C ., Brero, A., Stein, S ., von Hase, J . , Cremer, C ., Cremer, T. and Solovei, I. (2003 )Three-dimensional arrangements of centromeres and telomeres in nuclei of human DNA murine lymphocutes.Chromosome Res. 11, 485-502.
15. Desel, C., Jung, C ., Cai, D. G ., Kleine, M. and Schmidt, T. (2001) High-resoltion mapping of YACsand the single-copy gene Hslpro-l on Beta vulgaris chromosome by multi-colour flurosecence in situ hybridization. Plant Mol. Biol. 4 5, 113-1 22.
16. Fransz, P. F, Stam, M ., Montijn, B ., Ten Hoopen, R ., Wiegant, J . , Kooter, J. M ., Oud, 0. and Nan-niga, N. ( 1996) Detection of single-copy genes and chromosome rearrangements in Petunia hybrida by fluorescence in situ hybridization. Plant J. 9 , 767-774.
17. Pedersen, C ., Zimny, J . , Becker, D ., Jhne-Grtner, A. and Lrz, H. (1997) Localization of introducedgenes on the chromosomes of transgenic barley, wheat and triticale by fluorescence in situ hybridization.Theor. AppL Genet. 9 4 , 7 49-757.
18. Leggett, J. M ., Perret, S. J . , Harper, J. and Morris, P. (2 0 0 0 ) Chromosomal localization ofcotransformed transgenes in the hexaploid cultivated oat Avena sativaL. using fluorescence in situ hybridization. Heredity 8 4 , 46-53.
19. Salvo-Garrido, H ., Travella, S ., Schwarzacher, T, Harwood, W. A. and Snape, J. W. (2001 ) An efficient method for the physical mapping of transgenes in barley using in situ hybridization. Genome 44 ,104-110.
20. Salvo-Garrido, H ., Travella, S ., Bilham, L. J . , Harwood, W. A. and Snape, J. W. (200 4 ) The distribution of transgene insertion sites in barley determined by physical and genetic mapping. Genetics 167,1371-1379.
21. Harper G ., Osuji J. O ., Heslop-Hairison J. S. and Hull R. 1999. Integration of banana streak badnavirusinto the Musa genome ： molecular and cytogenetic evidence. Virology255, 207-213.
22. Richert-Pggeler, K. R ., Noreen, F, Schwarzacher, T, Harper, G. and Hohn, T. (2003) Induction of infectious Petunia vein clearing ( pararetro) virus from endogenous provirus in petunia. EMBO J. 22,4 836-4 8 4 5.
23. Staginnus, C . ，Gregor, F ，Mette, M. F ., Teo, C. H ., Borroto-Femandez, E. G ., Laimer da CamaraMachado, M ., Matzke, M. and Schwarzacher, T. (2007 ) Endogenous pararetroviral sequences in tomato(Solanum lycopersicum) and related species. BMC Plant Biol. 7, 2 4.
24. Gall, J. G. and Pardue, M. L. ( 1969) Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytologi-cal preparations. P. N. A. 5. USA 63, 378-383.
25. John, H. A., Bimstiel, M. L. and Jones, K. W. ( 1969) RNA-DNA hybrids at the cytological level. Nature223, 582-587.
26. Nederlof, P. M, van der Flier, S ., Wiegant, J . , Raap, A. K ., Tanke, H. J . , Ploem, J. S. and van derPloeg, M. (1990) Multiple fluorescence in situ hybridization. Cytometry 11, 126-131.
27. Muller S ., Neusser M. and Wienberg J. 2002. Towards unlimited colors for fluorescence in-situ hybridization(FISH) Chromosome Res. 10, 223-232.
28. Mukai Y ., Ankara Y. and Yamamoto M. 1993. Simultaneous discrimination of the three genomes in hexa-ploid wheat by multicolour fluorescence in situ hybridization using total genomic and highly repeated DNAprobes. Genome 36, 489-494 .
29. Heslop-Harrison, J. S ., Schwarzacher, T, Anamthawat-Jonsson, K ., Leitch, A. R ., Shi, M. and Leitch,I. J. (1991) In situ hybridization with automated chromosome denaturation. Technique 3, 109-115.
30. Kohli A ., Twyman R. M ., Abranches R ., Wegel E ., Stoger E. and Christou P. (2003) Trans-gene integration, organization and interaction in plants. Plant Mol. Biol. 52, 247-258.
