转基因大米中Bt基因检测

2014 年7 月，央视日前报道了湖南、湖北、安徽、福建等4省存在转基因大米的新闻，引发社会极大关注。记者在武汉市一家大型超市，随机购买5种大米。经检测后发现，这5 种大米中，有3 种含转基因成分：Bt63。Bt63 是一种抗虫害的基因，它是苏云金芽孢杆菌基因中的杀虫晶体蛋白基因，可以有效防止鳞翅目等多种有害昆虫。

近年来转基因事件层出不穷，时有耳闻。那什么是转基因呢？转基因技术是提取特定生物体基因组中所需要的目的基因或者人工合成指定序列的DNA 片段，将该基因片段转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，获得具有稳定表现特定的遗传性状的个体。农作物转基因通常是为了获得抗病毒、抗虫、抗寒、抗旱、抗涝、抗盐碱、抗除草剂等特性。

中国目前并未批准转基因水稻的商业化生产。欧盟委员会决议：中国大米产品必须凭不含转基因Bt63大米成分的证书才能进入欧盟市场。其解释为：“转基因作物只有经过全面科学的评估和批准，才能允许投放入欧洲市场。”这一决定目的在于防止未被批准的转基因Bt63大米被欧洲消费者购买和食用。

可见大米中Bt基因的鉴别十分关键。检测大米中Bt基因有较多方法，RephiLe 以《农业部953 号公告-6-2007_转基因植物及其产品成分检测抗虫转Bt 基因水稻定性PCR 方法》为基础，推出大米Bt 基因检测解决方案，具体如下：

一、实验原理

根据转基因大米特异性序列设计引物，对试样进行PCR 扩增。对PCR 结果进行检测，确定是否含有转基因片段。

二、仪器和试剂

PCR 仪MyCycler (biorad,USA)

台式微量冷冻离心机Microfuge 22R （BeckmanCounter ,USA

凝胶成像系统Gel DocTM XR（biorad,USA）

紫外检测仪NanoDrop1000 (eppendorf,German)

核酸电泳仪EPS100 (上海天能)

超纯水仪Direct-Pure UP（RephiLe）

恒温水浴HH.S.21.8 (上海跃进医疗器械厂)

三、试验方法

1、试样预处理

将大米粉碎，制成待测样品。

2、基因组提取

使用Axygen 基因组DNA 小量试剂盒，按照其所述方法提取，UV 检测含量。

3、引物设计

4、PCR 条件

反应体系：使用DBI 2xTaq PCR Master Mix，按照说明，加入模板及引物。
反应条件：第一阶段95 ℃变性5 min；第二阶段35 次循环：94 ℃变性1 min，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s）；第三阶段72 ℃延伸7 min。

5、核酸检测

对PCR 产物进行凝胶电泳。SPS 扩增产物大小277 bp，Bt 扩增产物大小301 bp。

6、结果确认

采用含Bt 基因的质粒作为阳性对照，确认不含Bt 基因的水稻做印性对照。阳性对照SPS与Bt 基因都扩增出来，阴性对照只扩增出SPS 基因。

待测样本如扩增出SPS 基因，表明含水稻成份。

如扩增出SPS 基因和Bt 基因，表明含转基因水稻成份。

普通PCR 实验只能确定样本中是否含转基因成份。需要确认转基因水稻含量可以通过Realtime PCR 实验。

PCR 实验对于实验用水的要求非常高，水中的污染物会造成不同的损害：金属离子特别是Mg 等会影响Taq 酶的活性。有机物特别是腐殖酸和棕黄酸，会与DNA 缔合或者干扰酶，并影响荧光信号；DNA 酶会降解DNA。细菌在代谢的过程中会释放离子和有机物，产生各种干扰。因此，PCR 实验中必须使用无离子，无有机物，无细菌的超纯水。

为保证PCR 实验的准确性，生命科学实验室都会配备高质量的超纯水仪来进行实验，例如，中国科学院上海营养所、湖南农业大学袁隆平实验室等国内知名生物实验室使用的是RephiLe Direct-Pure UP 超纯水仪。Direct-Pure UP 超纯水仪以自来水为进水，生产RO 纯水和超纯水。

它采用两组大容量的双管纯化柱，有效去除水中的痕量金属离子，产水电阻率可达到18.2 MΩ•cm。内部超纯水定时循环，配合双波长紫外灯可以降低水中的有机物水平至5 ppb 以下。终端特别配置超滤除热原柱，可以有效去除细菌和热原等生物大分子物质。

Direct-Pure UP 超纯水仪适合包含PCR 在内的分子生物学实验使用。RO 纯水可以用于洗涤实验器皿，超纯水可以配置电泳Buffer，做空白对照等。