基因插入位点和模式
丁香园
152050
1. 引言
每一次独立的转化事件或采用不同的转基因策略，都会导致植物基因组中外源基因插入模式和位点数目的差异。在过去的 30 年里，农杆菌介导的转化方法是植物转基因技术的主流[1 ]。 20 世纪 80 年代，其首先应用于双子叶植物的转化[2]；90 年代，在单子叶植物的转化中获得成功 [3 ]。此外，基因枪 [6, 7 ] 和原生质体转化技术[4, 5 ] ，对于转基因技术基础和应用研究也是重要的补充 [ 8 ]。目前，除了一些依靠小片段同源序列相关的整合方法外[ 9 ]，大多数植物核基因组的转化方法主要依赖于外源基因的随机插入。因此，外源基因在植物核基因组中的插入位点和整合方式大都是不清楚的。从过去获得的大量转基因事件的分析，如 T- DNA 插入系，人们发现外源基因倾向于整合到基因富集区；然而，这可能仅仅是因为转基因过程中选择标记基因必须正常行使功能才能得到转基因植株。
由于外源 DNA 只整合到单个或多个不连锁的孟德尔位点，由农杆菌介导转化技术获得的转基因植株，一般含有较少的外源基因拷贝数，并且发生染色体重排的概率也非常有限，因此，其非常适合于构建可稳定遗传的转基因植物群体。同时，新一代双元载体的应用还限制了多余 DNA 片段，如载体本身的骨架序列 [10 ]，或非植物来源的 DNA 片段 [ 11 ] 转入植物基因组的可能性。而采用直接的转化技术时，其获得的转基因植株所含外源 DNA 片段经常会在单个孟德尔遗传位点形成很多的复杂插入 [12，13]，从而影响人们对转基因技术的有效控制。最近，基因枪技术有所改进，当采用不含骨架序列和低丰度的去磷酸化的线性 DNA 片段进行直接转化时，发现外源 DNA 片段在插入位点处所形成的结构获得了明显的改善。但是，对转基因插入位点处进行测序鉴定后，发现改进的基因枪技术会引起频繁的小范围重排，导致产生多个新的可读框，以及增加叶绿体 DNA 和外源基因共整合的频率。
本章列举了两例转基因事件，对不同的转基因方法加以说明。这两例事件采用的载体均为双元载体：选择性标记基因潮霉素基因和报告基因 β-葡萄糖醛酸酶基因位于同一个T-DNA 区。一个转化采用的是粒子轰击法（基因枪法，称为事件 1 ) ，另一个采用农杆菌介导转化方法（称为事件 2 ) 。为了确保其能在植物核基因组中顺利表达，外源基因的两端分别加上了启动子和终止子，同时假设其在质体基因组中不会发生插入和表达。
2. 研究材料
一、遗传研究
1. 耗材和仪器设备
( 1 ) 可供植株生长的入工智能气候箱或温室
( 2 ) 可控的植物组织培养室（25℃）
( 3 ) 37℃ 温控摇床
( 4 ) 超净工作台
( 5 ) 立体显微镜（Leica MZ6)
( 6 ) PCR 仪
( 7 ) 凝胶成像分析仪（Bio- Rad)
( 8 ) 水平电泳仪
( 9 ) 真空箱
( 10 ) 天平
( 11 ) 冰箱（4℃ 冷藏和 -20℃ 冷冻）
( 12 ) 微量移液器和配备的吸头
( 13 ) 移液管（10 ml 和 20 ml )
( 14 ) 冰
( 15 ) 液氮
( 16 ) 滤纸（如 Whatman)
( 17 ) 96 孔、24 孔或者 6 孔的一次性塑料板
( 18 ) 微量离心管（0.2 ml、0.5 ml、1.5 ml 和 2 ml)
( 19 ) 15 ml 和 50 ml 的离心管
( 20 ) 塑料培养皿（直径 9 cm)
( 21 ) 解剖刀和镊子
2. 试剂
( 1 ) 乙醇（70% )
( 2 ) 次氯酸钠（Fluka 71696)
( 3 ) 无菌去离子水
( 4 ) MS 培养基：Murashige and Skoog 培养基+维生素 B5 (Duchefa M0231)，10 g/L 蔗糖，6 g/L 琼脂粉，2 g/L 植物凝胶，pH 5.8
( 5 ) β-葡萄糖醛酸酶基因活性测定液：100 mg X-gluc ( C14H13BrClNO7 C6H13N ) 溶于 2 ml DMSO ( 二甲基亚砜），用 10 mmol/L EDTA 定容到 200 ml，0.1% Triton X-100，100 mmol/L Na3PO4，pH 7.0
( 6 ) 植物组织 DNA 提取试剂盒（Qiagen，#69104 )
( 7 ) Taq DNA 聚合酶（如 GE Healthcare UK Ltd，27-0799-06) 和 10x 反应缓冲液
( 8 ) dNTP 储存液（2 mmol/L)
( 9 ) 引物（10 μmol/L) ( 如 β-葡萄糖醛酸酶基因的正向和反向引物；看家基因的正向和反向引物）
( 10 ) 琼脂糖
( 11 ) 溴化乙锭：10 mg/ml 储存液
( 12 ) 10x TBE 电泳缓冲液：0.89 mol/L Tris-base，0.89 mol/L H3BO3，0.025 mol/L EDTA，pH 8.3
二、Southern 分析
1. 耗材和仪器设备
( 1 ) 感光成像仪（如 Typhoon 9200， Amersham Biosciences)
( 2 ) 分光光度计和石英比色皿
( 3 ) 凝胶成像分析仪（ Bio- Rad)
( 4 ) 温控摇床 37℃ 和 65℃
( 5 ) PCR 仪
( 6 ) 光密度计（如 Bio-Rad 690)
( 7 ) 冰箱（4℃、-20℃ 和 -80℃)
( 8 ) Speedvac DNA110 离心机
( 9 ) 水平电泳仪（如 gel tank systems with power supply)
( 10 ) 台式振荡器
( 11 ) 磷屏（如 Molecular Dynamics)
( 12 ) 放射性自显影胶片
( 13 ) DNA 测序服务或设备
( 14 ) 尼龙膜（Amersham )
( 15 ) 印迹设备（如塑料盘、玻璃板、印迹纸）
( 16 ) 研钵、研棒或一次性塑料研棒
( 17 ) 塑料离心管（15 ml 和 50 ml)
( 18 ) 微型离心管（0.2 ml、0.5 ml、1.5 ml 和 2 ml)
( 19 ) 保鲜膜
( 20 ) 微量移液器和配备的吸头
( 21 ) 移液管（10 ml 和 20 ml)
( 22 ) 冰
( 23 ) 液氮
2. 试剂
( 1 ) 植物基因组提取试剂盒（ Amersham Biosciences)
( 2 ) 植物基因组小量提取试剂盒（ Qiagen，#69104)
( 3 ) 凝胶回收试剂盒（ Qiagen，#28101)
( 4 ) PCR 回收试剂盒（Qiagen，#28104)
( 5 ) 限制性内切核酸酶和相应的反应缓冲液
( 6 ) DNA 测序试剂盒
( 7 ) 琼脂糖
( 8 ) 10xTBE 电泳缓冲液：0.89 mol/L Tris-base，0.89 mol/L H3BO3，0.025 mol/L EDTA，pH 8.3
( 9 ) 噬菌体 DNA
( 10 ) 溴化乙锭（10 mg/ml)
( 11 ) 无菌去离子水
( 12 ) DNA 聚合酶 I ，Klenow 片段
( 13 ) [ 32P ] 标记的 dCTP ( Amersham )
( 14 ) 载体 DNA ( 高压后的鲱鱼精 DNA，5 g/L )
( 15 ) OLB ( 寡核苷酸标记缓冲液）：2 ml ( 1.25 mol/L Tris-HCl，pH 8.0 和 0.125 mol/L MgCl2) ，36 μl β-巯基乙醇，10 μl dATP，10 μl dTTP，10 μl dGTP，5165 μl 的 2 mol/L 羟乙基哌嗪乙硫磺酸（pH 6.6 )，3099 μl 的 90 OD260 U 随机引物/μl
( 16 ) BSA ( 小牛血清白蛋白，50 mg/ml)
( 17 ) 1/10 TE 溶液：3 mmol/L Tris-HCl，pH 7.0 和 0.02 mmol/L 的 EDTA，pH 8.0
( 18 ) SDS ( 十二烷基硫酸钠，10% m/V )
( 19 ) 0.25 mol/L HCl
( 20 ) 0.4 mol/L 和 3 mol/L NaOH
( 21 ) 20x SSC: 3 mol/L NaCl 和 0.3 mol/L Na3C6H9O9，pH 7.0
( 22 ) 5x HSB：175.3 g NaCl，30.3 g PIPES 和 7.45 g Na2EDTA 2H2O 用纯水定容至 1 L，后用 NaOH 调至 pH 6.8 。
( 23 ) Denhardt 溶液Ⅲ：2 g 明胶，2 g Ficoll-400，2 g 聚乙烯吡咯烷酮 360，10 g SDS、5 g Na2P2O410H2O，65℃ 溶于 100 ml 水中。
3. 注释
注 1 : 由于禾谷类作物本身天然具有很髙的抗性水平，因此对完整种子（ 如放在含有抗生素的润湿的滤纸或者琼脂培养基上进行萌发）或植株（如用抗生素溶液涂叶片）做抗生素抗性筛选常常无效。如果抗性筛选必不可少，成熟的胚应从灭菌后的种子上切下，然后胚轴朝下放在含有与筛选 T。代植物相同抗生素浓度的固体培养基上培养。
注 2 : 基因沉默会导致将无转基因表达的后代误判为阴性个体，这将会使阴性个体的观察值偏高，从而会低估转基因插入位点的个数（见表 13. 2 中的事例2 ) 。当凡代转基因植株含有多个转基因插入位点时，外源基因的沉默发生频率会更高。当只用一种载体进行水稻转化时，基于外源基因表达活性进行插入位点数的评估时，错误率为 36% [23]。当用多种载体或 DNA 片段进行共转化时（如用基因枪转多个片段），后代植株中每一个目标基因的活性都必须进行鉴定。例如，如果转化时一个 T-DNA 含有 β-葡萄糖醛酸酶基因，另一个 T-DNA 含有 LUC 基因，则在对 T1 代植株的分离情况进行调查时，两个基因的活性都必须进行测定。然后将观察值与双基因孟德尔遗传理论值 ( 表13.3 ) 进行比较和卡方分析。水稻中，当同时用两种 T-DNA 进行共转化时，依据外源基因的表达活性对外源基因插入位点数进行评估，错误率为 78% [15]。因此如果需要对转基因植株中插入位点进行精确鉴定，基于表型分离的遗传分析结果只能是分子分析方法的一种补充。
注 3 : 在进行成熟植株 DNA 的提取时，幼嫩叶片一般比较好。对于水稻等某些特定农作物的 DNA，为了尽量减少多糖和酚类复合物的存在，植株可以先在黑暗的环境下放置 1~2 天，这样可以提髙抽提的植物 DNA 的质量和数量。
注 4 : 尽量避免存储于微型管里的 DNA 溶液进行反复的冻融和离心，因为这样经常会造成 DNA 的断裂。
注 5 : 为了保证酶切消化反应液的体积，可以用 PCR 仪进行消化，因为 PCR 仪的热盖可以防止反应液在微型离心管盖上的凝结。
注 6 : 当外源基因插入位点数和拷贝数非常多，或者物种本身的自交难度较大时，如一些草本植物存在自交不亲和，进行 T。代和后代植株之间的 Southern 杂交结果的比较分析就比较困难。转基因后代植株的数量，至少要保证对每个独立插入位点都实行鉴定。根据已有的经验，要实现对 2 个、 3 个和4 个插入位点的 Southern 杂交鉴定，至少分别要保证有 8 个、 20 个和 30 个自交后代。而当转基因植株含有 3 或 4 个插入位点时，至少要有32 个 和 128 个后代植株，才有机会完成对每个插入位点的单独分析。实践中，当转基因植株含有 2 个以上的插入位点时，相对于 Southern 杂交分析，最好还是采用 3.1 节中详细介绍的基于基因型进行的遗传分析方法。
注 7 : 当对外源基因的插入位点数一无所知时，T0 代植株的 Southern 分析就要比较谨慎了，因为复杂的杂交带型并不代表单个位点中含有多重拷贝，而有可能是由多个插入位点所引起的。通过农杆菌介导获得的转基因植株一般都有多个插入位点。前入对于水稻的研究表明，一半以上的转基因植株均含有多个 T-DNA 插入位点[23]。
注 8 : 进行重杂交之前，应该先在标准条件下曝光，以确定膜的背景信号（如用与探针杂交后一致的曝光时间）。人为造成的背景差异会影响转基因拷贝数和插入位点鉴定结果的精确性。多拷贝数（20 或以上）基因杂交信号的衰减时间会很长。将膜放在煮沸的 500 ml 0.1x SSC 和 0.5% SDS 中洗脱三次，每次 5 min，以去除残留的杂交信号。
注 9 : 如果条件允许，在 Southern 分析时最好避免使用对 CpG 和 CpNpG 甲基化敏感或者有星号活性的限制酶，这样可以尽量减少由于酶切而造成的对转基因插入位点复杂性的误判。
注 10 : 根据载体 T- DNA 边界外序列设计的探针进行的 Southern 分析，可以用来检测小片段骨架序列整合至植物基因组的概率。
注 11: DNA的纯度低、限制酶用量的不够或者酶切消化体积的偏小，都有可能会导致 Southern 杂交带型发生改变。例如，限制性内切核酸酶用量的减少会导致完整的 HPT- GUS 条带的信号减弱，而相应的大分子质量的条带信号增强（ 图 13.6)。这一结果表明，在 Southern 分析中出现的较为复杂的高分子质量的杂交条带，也可能是因为限制性内切核酸酶酶量不足导致的一种假象。因此，在鉴定这些杂交条带时需格外小心谨慎，尤其是把这些杂交条带的信号强度作为鉴别标准时，要考虑是否有人为因素影响。
注 12 : 应该进行多次，如三次以上，测定用于作为标样的植物基因组和质粒 DNA 的浓度。由于 DNA 浓度测定的偏差，有可能会影响后续转基因拷贝数的测定结果的准确性。要引起重视的是，通过分光光度计测定的 DNA 标样浓度，往往要比用凝胶分析和溴化乙锭染色后，再与高精准商业 DNA ( 如 λ 噬菌体 DNA) 进行比较所获得的 DNA 标样浓度的准确性要差。所有的 DNA 样品浓度应该采用相同的测定方法，如果可能的话最好同批次测定。
注 13 : 通过梯度稀释获得与每个基因组含有 1~40 个拷贝的转基因相当的质粒 DNA，并将这些质粒 DNA 分别加到一定量的野生型植物基因组 DNA 中，用于制备标样。当质粒 DNA 浓度较低时，应该采用 1/10 TE 进行稀释，从而可以减少质粒 DNA 的降解。每个野生型基因组中加入 2 分子的质粒来代表转基因中单拷贝的纯合型，如事例 2 中的 T2 代转基因植株。在分析 T。代转基因植株时，由于插入位点处为杂合型，每个基因组中只加入1 分子的质粒。以水稻为例， 63 pg 的质粒（5792 bp) 在 5 μg T2 代水稻基因组 DNA 中相当于 1 个基因组中有1 个拷贝的外源插入（5792 bp x 660 Da/bpx1.65x10-24 g/Da= 6.3x10-18 g/plasmid，5 μg 水稻 DNA/0.5 pg 每个水稻基因组=107 基因组，6.3X10-18X107 g=63 pg 质粒对于每个 2 C 水稻基因组）。代表高拷贝数的外源基因插入的标样会产生的强杂交信号，信号衰减的时间比较长，甚至用化学法洗膜后信号还存在（见标注8) 。制备标样 DNA 时，可以在野生型 DNA 中加入多个不同的转基因质粒，但需保证这些质粒酶切后的产物长度不同，且其长度差异足够防止后期杂交信号的相互干扰。
注 14 : 大量提取已经鉴定过的 1 个（最好为 2 个）转基因系（ 作为阳性对照）和野生型（作为阴性对照和可以和质粒 DNA 混合建立标样）的 DNA 是很有用的。提好后 ，分装成一次酶切的所需量，并保存于 -20℃ 环境下。这样也能保证后续试验中，相同来源的 DNA 用量保持一致，保证最终结果可用光密度计来量化。当用基因组 RFLP 探针进行杂交时，阳性对照和阴性对照所得到的信号可以用来标准化转基因植株 DNA 的上用量。当用转基因序列探针进行杂交时，膜间阳性对照信号的差异可以用来评估所测得的转基因拷贝数的误差。
注 15 : 在同一张膜上每个转基因植株推荐进行两次分析（如用两种不同的酶消化），以保证两次实验所得到的转基因拷贝数结果可以相互验证。
4. 参考文献
1. Vain, P. (2 0 0 7 ) Thirty years of plant transformation technology development. Plant BiotechnoL J. 5,221-229.
2. Zambryski, P ., Joos, H, Genetello, C, Lee-mans, J, Van Montagu, M. and Schell, J. (1983) Ti-plasmidvector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capacity.EMBO J. 2 , 21 4 3-2150.
3. Hiei, Y ., Ohta, S, Komari, T. and Kumashiro, T. ( 199 4 ) Efficient transformation of rice ( Oryza sativaL .) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J. 6, 271-282.
4. Paszkowski, J, Shillito, R. D, Saul, M, Mandak, V., Hohn, T ., Hohn, B. and Potrykus^ I. (198 4 ) Direct gene transfer to plants. EMBO /. 3, 2111-2122.
5. Shimamoto, K, Terada, R, Izawa, T. and Fujimoto, H. ( 1989) Fertile transgenic rice plants regeneratedfrom transformed protoplasts. Nature 338, 27 4 -276.
6. Gordonkamm, W. J, Spencer, T. M, Mangano, M. L, Adams, T. R, Daines, R. J . , Start, W. G, Obrien,J. V, Chambers, S. A, Adams, W. R, Willetts, N. G, Rice, T. B, Mackey, C. J, Krueger, R. W,Kausch, A. P. and Lemaux, P. G. ( 1990) Transformation of maize cells and regeneration of fertile transgenic plants. Plant Cell 2 , 603-618.
7. McCabe, D. E ? Swain, W. F ., Martinell, B. J. and Christou, P. ( 1988) Stable transformation of soybean(G lycin e m a x) by particle acceleration. B io -T ech n o lo g y 6, 923-926.
8. Vain, P. (2006) Global trends in plant transgenic science and technology ( 1973-2003). Tren d s B io tech n o l.2 4 , 206-211.
9. Kohli, A, Leech, M, Vain, P . , Laurie, D. A. and Christou, P. (1998) Transgene organization in rice engineered through direct DNA transfer supports a two-phase integration mechanism mediated by the establishment of integration hot spots. P . N . A. 5. USA 95, 7203-7208.
10. Martineau, B, Voelker, T. A. and Sanders, R. A. (199 4 ) On defining T-DNA. P la n t C ell 6, 1032-1033.
11. Rommens, C. M, Humara, J. M, Ye, J. S, Yan, H, Richael, C, Zhang, L, Perry, R. and Swords, K.(200 4 ) Crop improvement through modification of the plant ’ s own genome. P la n t P h ysio l. 135, 421-4 31.
12. Vain, P ., Worland, B, Kohli, A, Snape, J. W ., Christou, P . , Allen, G. C. and Thompson, W. F.
(1999) Matrix attachment regions increase transgene expression levels and stability in transgenic rice plantsand their progeny. P la n t J. 18, 233-2 42.
13. Svitashev, S. K. and Somers, D. A. (2001) Genomic interspersions determine the size and complexity oftransgene loci in transgenic plants produced by microprojectile bombardment. Gen o m e 44 , 691-697.
14. Cluster, P. D, Odell, M, Metzlaff, M. and Flavell, R. B. (1996) Details of T-DNA structural organizationfrom a transgenic Petunia population exhibiting co-suppression. P la n t M o l. B io l. 32, 1197-1203.
15. Afolabi, A. S, Worland, B, Snape, J. W. and Vain, P. (200 4 ) A large-scale study of rice plants transformed with different T-DNAs provides new insights into locus composition and T-DNA linkage configurations. Theor. A p p l. Genet. 109, 815-826.
16. Lu, H. J, Zhou, X. R, Gong, Z. X. and Upadhyaya, N. M. (2001) Generation of selectable marker-freetransgenic rice using double right-border (DRB) binary vectors. A u st. J. P la n t P h ysio l. 28, 241-248.
17. Vain, P ., James, V. A., Worland, B. and Snape, J. W. (2002) Transgene behaviour across two generations in a large random population of transgenic rice plants produced by particle bombardment. Theor. A ppl.Genet. 105, 878-889.
18. Svitashev, S. K, Pawlowski, W. P ., Makarevitch, I., Plank, D. W. and Somers, D. A. (2002) Complextransgene locus structures implicate multiple mechanisms for plant transgene rearrangement. P la n t J. 32,433-445.
19. Son, D. Y, Ahn, K. M. and Lee, S. I. (2003) Sequencing, cloning and expression of CP4EPSPS roundupready soybean insert. F o o d S ci. B io tech n o l. 12, 133-136.
20. Spertini, D, Beliveau, C. and Bellemare, G. ( 1999) Screening of transgenic plants by amplification of unknown genomic DNA flanking T-DNA. B io tech n iq u es 27, 308-314.
21. Strizhov, N, Li, Y ., Rosso, M. G, Viehoever, P ., Dekker, K. A. and Weisshaar, B. (2003 ) High-throughput generation of sequence indexes from T-DNA mutagenized Arabidopsis thaliana lines.B io tech n iq u es 35, 1164-1168.
22. Sallaud, C, Meynard, D, Boxtel, J. Y, Gay, C, Bes, M, Brizard, J. P , Larmande, P . , Ortega, D .,Raynal, M, Portefaix, M, Ouwerkerk, P. B. F ., Rueb, S, Delseny, M. and Guiderdoni, E. (2003 )Highly efficient production and characterization of T-DNA plants for rice ( O ryza sa tiva L.) functional genomics. Theor. A p p l. Genet. 106, 1396-1408.
23. Vain, P ., Afolabi, A. S, Worland, B. and Snape, J. W. (2003 ) Transgene behaviour in populations ofrice plants transformed using a new dual binary vector system ： pGreen/ pSoup. Theor. A p p l. Genet. 107,210-217.
每一次独立的转化事件或采用不同的转基因策略，都会导致植物基因组中外源基因插入模式和位点数目的差异。在过去的 30 年里，农杆菌介导的转化方法是植物转基因技术的主流[1 ]。 20 世纪 80 年代，其首先应用于双子叶植物的转化[2]；90 年代，在单子叶植物的转化中获得成功 [3 ]。此外，基因枪 [6, 7 ] 和原生质体转化技术[4, 5 ] ，对于转基因技术基础和应用研究也是重要的补充 [ 8 ]。目前，除了一些依靠小片段同源序列相关的整合方法外[ 9 ]，大多数植物核基因组的转化方法主要依赖于外源基因的随机插入。因此，外源基因在植物核基因组中的插入位点和整合方式大都是不清楚的。从过去获得的大量转基因事件的分析，如 T- DNA 插入系，人们发现外源基因倾向于整合到基因富集区；然而，这可能仅仅是因为转基因过程中选择标记基因必须正常行使功能才能得到转基因植株。
由于外源 DNA 只整合到单个或多个不连锁的孟德尔位点，由农杆菌介导转化技术获得的转基因植株，一般含有较少的外源基因拷贝数，并且发生染色体重排的概率也非常有限，因此，其非常适合于构建可稳定遗传的转基因植物群体。同时，新一代双元载体的应用还限制了多余 DNA 片段，如载体本身的骨架序列 [10 ]，或非植物来源的 DNA 片段 [ 11 ] 转入植物基因组的可能性。而采用直接的转化技术时，其获得的转基因植株所含外源 DNA 片段经常会在单个孟德尔遗传位点形成很多的复杂插入 [12，13]，从而影响人们对转基因技术的有效控制。最近，基因枪技术有所改进，当采用不含骨架序列和低丰度的去磷酸化的线性 DNA 片段进行直接转化时，发现外源 DNA 片段在插入位点处所形成的结构获得了明显的改善。但是，对转基因插入位点处进行测序鉴定后，发现改进的基因枪技术会引起频繁的小范围重排，导致产生多个新的可读框，以及增加叶绿体 DNA 和外源基因共整合的频率。
本章列举了两例转基因事件，对不同的转基因方法加以说明。这两例事件采用的载体均为双元载体：选择性标记基因潮霉素基因和报告基因 β-葡萄糖醛酸酶基因位于同一个T-DNA 区。一个转化采用的是粒子轰击法（基因枪法，称为事件 1 ) ，另一个采用农杆菌介导转化方法（称为事件 2 ) 。为了确保其能在植物核基因组中顺利表达，外源基因的两端分别加上了启动子和终止子，同时假设其在质体基因组中不会发生插入和表达。
2. 研究材料
一、遗传研究
1. 耗材和仪器设备
( 1 ) 可供植株生长的入工智能气候箱或温室
( 2 ) 可控的植物组织培养室（25℃）
( 3 ) 37℃ 温控摇床
( 4 ) 超净工作台
( 5 ) 立体显微镜（Leica MZ6)
( 6 ) PCR 仪
( 7 ) 凝胶成像分析仪（Bio- Rad)
( 8 ) 水平电泳仪
( 9 ) 真空箱
( 10 ) 天平
( 11 ) 冰箱（4℃ 冷藏和 -20℃ 冷冻）
( 12 ) 微量移液器和配备的吸头
( 13 ) 移液管（10 ml 和 20 ml )
( 14 ) 冰
( 15 ) 液氮
( 16 ) 滤纸（如 Whatman)
( 17 ) 96 孔、24 孔或者 6 孔的一次性塑料板
( 18 ) 微量离心管（0.2 ml、0.5 ml、1.5 ml 和 2 ml)
( 19 ) 15 ml 和 50 ml 的离心管
( 20 ) 塑料培养皿（直径 9 cm)
( 21 ) 解剖刀和镊子
2. 试剂
( 1 ) 乙醇（70% )
( 2 ) 次氯酸钠（Fluka 71696)
( 3 ) 无菌去离子水
( 4 ) MS 培养基：Murashige and Skoog 培养基+维生素 B5 (Duchefa M0231)，10 g/L 蔗糖，6 g/L 琼脂粉，2 g/L 植物凝胶，pH 5.8
( 5 ) β-葡萄糖醛酸酶基因活性测定液：100 mg X-gluc ( C14H13BrClNO7 C6H13N ) 溶于 2 ml DMSO ( 二甲基亚砜），用 10 mmol/L EDTA 定容到 200 ml，0.1% Triton X-100，100 mmol/L Na3PO4，pH 7.0
( 6 ) 植物组织 DNA 提取试剂盒（Qiagen，#69104 )
( 7 ) Taq DNA 聚合酶（如 GE Healthcare UK Ltd，27-0799-06) 和 10x 反应缓冲液
( 8 ) dNTP 储存液（2 mmol/L)
( 9 ) 引物（10 μmol/L) ( 如 β-葡萄糖醛酸酶基因的正向和反向引物；看家基因的正向和反向引物）
( 10 ) 琼脂糖
( 11 ) 溴化乙锭：10 mg/ml 储存液
( 12 ) 10x TBE 电泳缓冲液：0.89 mol/L Tris-base，0.89 mol/L H3BO3，0.025 mol/L EDTA，pH 8.3
二、Southern 分析
1. 耗材和仪器设备
( 1 ) 感光成像仪（如 Typhoon 9200， Amersham Biosciences)
( 2 ) 分光光度计和石英比色皿
( 3 ) 凝胶成像分析仪（ Bio- Rad)
( 4 ) 温控摇床 37℃ 和 65℃
( 5 ) PCR 仪
( 6 ) 光密度计（如 Bio-Rad 690)
( 7 ) 冰箱（4℃、-20℃ 和 -80℃)
( 8 ) Speedvac DNA110 离心机
( 9 ) 水平电泳仪（如 gel tank systems with power supply)
( 10 ) 台式振荡器
( 11 ) 磷屏（如 Molecular Dynamics)
( 12 ) 放射性自显影胶片
( 13 ) DNA 测序服务或设备
( 14 ) 尼龙膜（Amersham )
( 15 ) 印迹设备（如塑料盘、玻璃板、印迹纸）
( 16 ) 研钵、研棒或一次性塑料研棒
( 17 ) 塑料离心管（15 ml 和 50 ml)
( 18 ) 微型离心管（0.2 ml、0.5 ml、1.5 ml 和 2 ml)
( 19 ) 保鲜膜
( 20 ) 微量移液器和配备的吸头
( 21 ) 移液管（10 ml 和 20 ml)
( 22 ) 冰
( 23 ) 液氮
2. 试剂
( 1 ) 植物基因组提取试剂盒（ Amersham Biosciences)
( 2 ) 植物基因组小量提取试剂盒（ Qiagen，#69104)
( 3 ) 凝胶回收试剂盒（ Qiagen，#28101)
( 4 ) PCR 回收试剂盒（Qiagen，#28104)
( 5 ) 限制性内切核酸酶和相应的反应缓冲液
( 6 ) DNA 测序试剂盒
( 7 ) 琼脂糖
( 8 ) 10xTBE 电泳缓冲液：0.89 mol/L Tris-base，0.89 mol/L H3BO3，0.025 mol/L EDTA，pH 8.3
( 9 ) 噬菌体 DNA
( 10 ) 溴化乙锭（10 mg/ml)
( 11 ) 无菌去离子水
( 12 ) DNA 聚合酶 I ，Klenow 片段
( 13 ) [ 32P ] 标记的 dCTP ( Amersham )
( 14 ) 载体 DNA ( 高压后的鲱鱼精 DNA，5 g/L )
( 15 ) OLB ( 寡核苷酸标记缓冲液）：2 ml ( 1.25 mol/L Tris-HCl，pH 8.0 和 0.125 mol/L MgCl2) ，36 μl β-巯基乙醇，10 μl dATP，10 μl dTTP，10 μl dGTP，5165 μl 的 2 mol/L 羟乙基哌嗪乙硫磺酸（pH 6.6 )，3099 μl 的 90 OD260 U 随机引物/μl
( 16 ) BSA ( 小牛血清白蛋白，50 mg/ml)
( 17 ) 1/10 TE 溶液：3 mmol/L Tris-HCl，pH 7.0 和 0.02 mmol/L 的 EDTA，pH 8.0
( 18 ) SDS ( 十二烷基硫酸钠，10% m/V )
( 19 ) 0.25 mol/L HCl
( 20 ) 0.4 mol/L 和 3 mol/L NaOH
( 21 ) 20x SSC: 3 mol/L NaCl 和 0.3 mol/L Na3C6H9O9，pH 7.0
( 22 ) 5x HSB：175.3 g NaCl，30.3 g PIPES 和 7.45 g Na2EDTA 2H2O 用纯水定容至 1 L，后用 NaOH 调至 pH 6.8 。
( 23 ) Denhardt 溶液Ⅲ：2 g 明胶，2 g Ficoll-400，2 g 聚乙烯吡咯烷酮 360，10 g SDS、5 g Na2P2O410H2O，65℃ 溶于 100 ml 水中。
3. 注释
注 1 : 由于禾谷类作物本身天然具有很髙的抗性水平，因此对完整种子（ 如放在含有抗生素的润湿的滤纸或者琼脂培养基上进行萌发）或植株（如用抗生素溶液涂叶片）做抗生素抗性筛选常常无效。如果抗性筛选必不可少，成熟的胚应从灭菌后的种子上切下，然后胚轴朝下放在含有与筛选 T。代植物相同抗生素浓度的固体培养基上培养。
注 2 : 基因沉默会导致将无转基因表达的后代误判为阴性个体，这将会使阴性个体的观察值偏高，从而会低估转基因插入位点的个数（见表 13. 2 中的事例2 ) 。当凡代转基因植株含有多个转基因插入位点时，外源基因的沉默发生频率会更高。当只用一种载体进行水稻转化时，基于外源基因表达活性进行插入位点数的评估时，错误率为 36% [23]。当用多种载体或 DNA 片段进行共转化时（如用基因枪转多个片段），后代植株中每一个目标基因的活性都必须进行鉴定。例如，如果转化时一个 T-DNA 含有 β-葡萄糖醛酸酶基因，另一个 T-DNA 含有 LUC 基因，则在对 T1 代植株的分离情况进行调查时，两个基因的活性都必须进行测定。然后将观察值与双基因孟德尔遗传理论值 ( 表13.3 ) 进行比较和卡方分析。水稻中，当同时用两种 T-DNA 进行共转化时，依据外源基因的表达活性对外源基因插入位点数进行评估，错误率为 78% [15]。因此如果需要对转基因植株中插入位点进行精确鉴定，基于表型分离的遗传分析结果只能是分子分析方法的一种补充。
注 3 : 在进行成熟植株 DNA 的提取时，幼嫩叶片一般比较好。对于水稻等某些特定农作物的 DNA，为了尽量减少多糖和酚类复合物的存在，植株可以先在黑暗的环境下放置 1~2 天，这样可以提髙抽提的植物 DNA 的质量和数量。
注 4 : 尽量避免存储于微型管里的 DNA 溶液进行反复的冻融和离心，因为这样经常会造成 DNA 的断裂。
注 5 : 为了保证酶切消化反应液的体积，可以用 PCR 仪进行消化，因为 PCR 仪的热盖可以防止反应液在微型离心管盖上的凝结。
注 6 : 当外源基因插入位点数和拷贝数非常多，或者物种本身的自交难度较大时，如一些草本植物存在自交不亲和，进行 T。代和后代植株之间的 Southern 杂交结果的比较分析就比较困难。转基因后代植株的数量，至少要保证对每个独立插入位点都实行鉴定。根据已有的经验，要实现对 2 个、 3 个和4 个插入位点的 Southern 杂交鉴定，至少分别要保证有 8 个、 20 个和 30 个自交后代。而当转基因植株含有 3 或 4 个插入位点时，至少要有32 个 和 128 个后代植株，才有机会完成对每个插入位点的单独分析。实践中，当转基因植株含有 2 个以上的插入位点时，相对于 Southern 杂交分析，最好还是采用 3.1 节中详细介绍的基于基因型进行的遗传分析方法。
注 7 : 当对外源基因的插入位点数一无所知时，T0 代植株的 Southern 分析就要比较谨慎了，因为复杂的杂交带型并不代表单个位点中含有多重拷贝，而有可能是由多个插入位点所引起的。通过农杆菌介导获得的转基因植株一般都有多个插入位点。前入对于水稻的研究表明，一半以上的转基因植株均含有多个 T-DNA 插入位点[23]。
注 8 : 进行重杂交之前，应该先在标准条件下曝光，以确定膜的背景信号（如用与探针杂交后一致的曝光时间）。人为造成的背景差异会影响转基因拷贝数和插入位点鉴定结果的精确性。多拷贝数（20 或以上）基因杂交信号的衰减时间会很长。将膜放在煮沸的 500 ml 0.1x SSC 和 0.5% SDS 中洗脱三次，每次 5 min，以去除残留的杂交信号。
注 9 : 如果条件允许，在 Southern 分析时最好避免使用对 CpG 和 CpNpG 甲基化敏感或者有星号活性的限制酶，这样可以尽量减少由于酶切而造成的对转基因插入位点复杂性的误判。
注 10 : 根据载体 T- DNA 边界外序列设计的探针进行的 Southern 分析，可以用来检测小片段骨架序列整合至植物基因组的概率。
注 11: DNA的纯度低、限制酶用量的不够或者酶切消化体积的偏小，都有可能会导致 Southern 杂交带型发生改变。例如，限制性内切核酸酶用量的减少会导致完整的 HPT- GUS 条带的信号减弱，而相应的大分子质量的条带信号增强（ 图 13.6)。这一结果表明，在 Southern 分析中出现的较为复杂的高分子质量的杂交条带，也可能是因为限制性内切核酸酶酶量不足导致的一种假象。因此，在鉴定这些杂交条带时需格外小心谨慎，尤其是把这些杂交条带的信号强度作为鉴别标准时，要考虑是否有人为因素影响。
注 12 : 应该进行多次，如三次以上，测定用于作为标样的植物基因组和质粒 DNA 的浓度。由于 DNA 浓度测定的偏差，有可能会影响后续转基因拷贝数的测定结果的准确性。要引起重视的是，通过分光光度计测定的 DNA 标样浓度，往往要比用凝胶分析和溴化乙锭染色后，再与高精准商业 DNA ( 如 λ 噬菌体 DNA) 进行比较所获得的 DNA 标样浓度的准确性要差。所有的 DNA 样品浓度应该采用相同的测定方法，如果可能的话最好同批次测定。
注 13 : 通过梯度稀释获得与每个基因组含有 1~40 个拷贝的转基因相当的质粒 DNA，并将这些质粒 DNA 分别加到一定量的野生型植物基因组 DNA 中，用于制备标样。当质粒 DNA 浓度较低时，应该采用 1/10 TE 进行稀释，从而可以减少质粒 DNA 的降解。每个野生型基因组中加入 2 分子的质粒来代表转基因中单拷贝的纯合型，如事例 2 中的 T2 代转基因植株。在分析 T。代转基因植株时，由于插入位点处为杂合型，每个基因组中只加入1 分子的质粒。以水稻为例， 63 pg 的质粒（5792 bp) 在 5 μg T2 代水稻基因组 DNA 中相当于 1 个基因组中有1 个拷贝的外源插入（5792 bp x 660 Da/bpx1.65x10-24 g/Da= 6.3x10-18 g/plasmid，5 μg 水稻 DNA/0.5 pg 每个水稻基因组=107 基因组，6.3X10-18X107 g=63 pg 质粒对于每个 2 C 水稻基因组）。代表高拷贝数的外源基因插入的标样会产生的强杂交信号，信号衰减的时间比较长，甚至用化学法洗膜后信号还存在（见标注8) 。制备标样 DNA 时，可以在野生型 DNA 中加入多个不同的转基因质粒，但需保证这些质粒酶切后的产物长度不同，且其长度差异足够防止后期杂交信号的相互干扰。
注 14 : 大量提取已经鉴定过的 1 个（最好为 2 个）转基因系（ 作为阳性对照）和野生型（作为阴性对照和可以和质粒 DNA 混合建立标样）的 DNA 是很有用的。提好后 ，分装成一次酶切的所需量，并保存于 -20℃ 环境下。这样也能保证后续试验中，相同来源的 DNA 用量保持一致，保证最终结果可用光密度计来量化。当用基因组 RFLP 探针进行杂交时，阳性对照和阴性对照所得到的信号可以用来标准化转基因植株 DNA 的上用量。当用转基因序列探针进行杂交时，膜间阳性对照信号的差异可以用来评估所测得的转基因拷贝数的误差。
注 15 : 在同一张膜上每个转基因植株推荐进行两次分析（如用两种不同的酶消化），以保证两次实验所得到的转基因拷贝数结果可以相互验证。
4. 参考文献
1. Vain, P. (2 0 0 7 ) Thirty years of plant transformation technology development. Plant BiotechnoL J. 5,221-229.
2. Zambryski, P ., Joos, H, Genetello, C, Lee-mans, J, Van Montagu, M. and Schell, J. (1983) Ti-plasmidvector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capacity.EMBO J. 2 , 21 4 3-2150.
3. Hiei, Y ., Ohta, S, Komari, T. and Kumashiro, T. ( 199 4 ) Efficient transformation of rice ( Oryza sativaL .) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J. 6, 271-282.
4. Paszkowski, J, Shillito, R. D, Saul, M, Mandak, V., Hohn, T ., Hohn, B. and Potrykus^ I. (198 4 ) Direct gene transfer to plants. EMBO /. 3, 2111-2122.
5. Shimamoto, K, Terada, R, Izawa, T. and Fujimoto, H. ( 1989) Fertile transgenic rice plants regeneratedfrom transformed protoplasts. Nature 338, 27 4 -276.
6. Gordonkamm, W. J, Spencer, T. M, Mangano, M. L, Adams, T. R, Daines, R. J . , Start, W. G, Obrien,J. V, Chambers, S. A, Adams, W. R, Willetts, N. G, Rice, T. B, Mackey, C. J, Krueger, R. W,Kausch, A. P. and Lemaux, P. G. ( 1990) Transformation of maize cells and regeneration of fertile transgenic plants. Plant Cell 2 , 603-618.
7. McCabe, D. E ? Swain, W. F ., Martinell, B. J. and Christou, P. ( 1988) Stable transformation of soybean(G lycin e m a x) by particle acceleration. B io -T ech n o lo g y 6, 923-926.
8. Vain, P. (2006) Global trends in plant transgenic science and technology ( 1973-2003). Tren d s B io tech n o l.2 4 , 206-211.
9. Kohli, A, Leech, M, Vain, P . , Laurie, D. A. and Christou, P. (1998) Transgene organization in rice engineered through direct DNA transfer supports a two-phase integration mechanism mediated by the establishment of integration hot spots. P . N . A. 5. USA 95, 7203-7208.
10. Martineau, B, Voelker, T. A. and Sanders, R. A. (199 4 ) On defining T-DNA. P la n t C ell 6, 1032-1033.
11. Rommens, C. M, Humara, J. M, Ye, J. S, Yan, H, Richael, C, Zhang, L, Perry, R. and Swords, K.(200 4 ) Crop improvement through modification of the plant ’ s own genome. P la n t P h ysio l. 135, 421-4 31.
12. Vain, P ., Worland, B, Kohli, A, Snape, J. W ., Christou, P . , Allen, G. C. and Thompson, W. F.
(1999) Matrix attachment regions increase transgene expression levels and stability in transgenic rice plantsand their progeny. P la n t J. 18, 233-2 42.
13. Svitashev, S. K. and Somers, D. A. (2001) Genomic interspersions determine the size and complexity oftransgene loci in transgenic plants produced by microprojectile bombardment. Gen o m e 44 , 691-697.
14. Cluster, P. D, Odell, M, Metzlaff, M. and Flavell, R. B. (1996) Details of T-DNA structural organizationfrom a transgenic Petunia population exhibiting co-suppression. P la n t M o l. B io l. 32, 1197-1203.
15. Afolabi, A. S, Worland, B, Snape, J. W. and Vain, P. (200 4 ) A large-scale study of rice plants transformed with different T-DNAs provides new insights into locus composition and T-DNA linkage configurations. Theor. A p p l. Genet. 109, 815-826.
16. Lu, H. J, Zhou, X. R, Gong, Z. X. and Upadhyaya, N. M. (2001) Generation of selectable marker-freetransgenic rice using double right-border (DRB) binary vectors. A u st. J. P la n t P h ysio l. 28, 241-248.
17. Vain, P ., James, V. A., Worland, B. and Snape, J. W. (2002) Transgene behaviour across two generations in a large random population of transgenic rice plants produced by particle bombardment. Theor. A ppl.Genet. 105, 878-889.
18. Svitashev, S. K, Pawlowski, W. P ., Makarevitch, I., Plank, D. W. and Somers, D. A. (2002) Complextransgene locus structures implicate multiple mechanisms for plant transgene rearrangement. P la n t J. 32,433-445.
19. Son, D. Y, Ahn, K. M. and Lee, S. I. (2003) Sequencing, cloning and expression of CP4EPSPS roundupready soybean insert. F o o d S ci. B io tech n o l. 12, 133-136.
20. Spertini, D, Beliveau, C. and Bellemare, G. ( 1999) Screening of transgenic plants by amplification of unknown genomic DNA flanking T-DNA. B io tech n iq u es 27, 308-314.
21. Strizhov, N, Li, Y ., Rosso, M. G, Viehoever, P ., Dekker, K. A. and Weisshaar, B. (2003 ) High-throughput generation of sequence indexes from T-DNA mutagenized Arabidopsis thaliana lines.B io tech n iq u es 35, 1164-1168.
22. Sallaud, C, Meynard, D, Boxtel, J. Y, Gay, C, Bes, M, Brizard, J. P , Larmande, P . , Ortega, D .,Raynal, M, Portefaix, M, Ouwerkerk, P. B. F ., Rueb, S, Delseny, M. and Guiderdoni, E. (2003 )Highly efficient production and characterization of T-DNA plants for rice ( O ryza sa tiva L.) functional genomics. Theor. A p p l. Genet. 106, 1396-1408.
23. Vain, P ., Afolabi, A. S, Worland, B. and Snape, J. W. (2003 ) Transgene behaviour in populations ofrice plants transformed using a new dual binary vector system ： pGreen/ pSoup. Theor. A p p l. Genet. 107,210-217.
