基因插入位点和模式
丁香园
144839
1. 引言
每一次独立的转化事件或采用不同的转基因策略，都会导致植物基因组中外源基因插入模式和位点数目的差异。在过去的 30 年里，农杆菌介导的转化方法是植物转基因技术的主流[1 ]。 20 世纪 80 年代，其首先应用于双子叶植物的转化[2]；90 年代，在单子叶植物的转化中获得成功 [3 ]。此外，基因枪 [6, 7 ] 和原生质体转化技术[4, 5 ] ，对于转基因技术基础和应用研究也是重要的补充 [ 8 ]。目前，除了一些依靠小片段同源序列相关的整合方法外[ 9 ]，大多数植物核基因组的转化方法主要依赖于外源基因的随机插入。因此，外源基因在植物核基因组中的插入位点和整合方式大都是不清楚的。从过去获得的大量转基因事件的分析，如 T- DNA 插入系，人们发现外源基因倾向于整合到基因富集区；然而，这可能仅仅是因为转基因过程中选择标记基因必须正常行使功能才能得到转基因植株。
由于外源 DNA 只整合到单个或多个不连锁的孟德尔位点，由农杆菌介导转化技术获得的转基因植株，一般含有较少的外源基因拷贝数，并且发生染色体重排的概率也非常有限，因此，其非常适合于构建可稳定遗传的转基因植物群体。同时，新一代双元载体的应用还限制了多余 DNA 片段，如载体本身的骨架序列 [10 ]，或非植物来源的 DNA 片段 [ 11 ] 转入植物基因组的可能性。而采用直接的转化技术时，其获得的转基因植株所含外源 DNA 片段经常会在单个孟德尔遗传位点形成很多的复杂插入 [12，13]，从而影响人们对转基因技术的有效控制。最近，基因枪技术有所改进，当采用不含骨架序列和低丰度的去磷酸化的线性 DNA 片段进行直接转化时，发现外源 DNA 片段在插入位点处所形成的结构获得了明显的改善。但是，对转基因插入位点处进行测序鉴定后，发现改进的基因枪技术会引起频繁的小范围重排，导致产生多个新的可读框，以及增加叶绿体 DNA 和外源基因共整合的频率。
本章列举了两例转基因事件，对不同的转基因方法加以说明。这两例事件采用的载体均为双元载体：选择性标记基因潮霉素基因和报告基因 β-葡萄糖醛酸酶基因位于同一个T-DNA 区。一个转化采用的是粒子轰击法（基因枪法，称为事件 1 ) ，另一个采用农杆菌介导转化方法（称为事件 2 ) 。为了确保其能在植物核基因组中顺利表达，外源基因的两端分别加上了启动子和终止子，同时假设其在质体基因组中不会发生插入和表达。
每一次独立的转化事件或采用不同的转基因策略，都会导致植物基因组中外源基因插入模式和位点数目的差异。在过去的 30 年里，农杆菌介导的转化方法是植物转基因技术的主流[1 ]。 20 世纪 80 年代，其首先应用于双子叶植物的转化[2]；90 年代，在单子叶植物的转化中获得成功 [3 ]。此外，基因枪 [6, 7 ] 和原生质体转化技术[4, 5 ] ，对于转基因技术基础和应用研究也是重要的补充 [ 8 ]。目前，除了一些依靠小片段同源序列相关的整合方法外[ 9 ]，大多数植物核基因组的转化方法主要依赖于外源基因的随机插入。因此，外源基因在植物核基因组中的插入位点和整合方式大都是不清楚的。从过去获得的大量转基因事件的分析，如 T- DNA 插入系，人们发现外源基因倾向于整合到基因富集区；然而，这可能仅仅是因为转基因过程中选择标记基因必须正常行使功能才能得到转基因植株。
由于外源 DNA 只整合到单个或多个不连锁的孟德尔位点，由农杆菌介导转化技术获得的转基因植株，一般含有较少的外源基因拷贝数，并且发生染色体重排的概率也非常有限，因此，其非常适合于构建可稳定遗传的转基因植物群体。同时，新一代双元载体的应用还限制了多余 DNA 片段，如载体本身的骨架序列 [10 ]，或非植物来源的 DNA 片段 [ 11 ] 转入植物基因组的可能性。而采用直接的转化技术时，其获得的转基因植株所含外源 DNA 片段经常会在单个孟德尔遗传位点形成很多的复杂插入 [12，13]，从而影响人们对转基因技术的有效控制。最近，基因枪技术有所改进，当采用不含骨架序列和低丰度的去磷酸化的线性 DNA 片段进行直接转化时，发现外源 DNA 片段在插入位点处所形成的结构获得了明显的改善。但是，对转基因插入位点处进行测序鉴定后，发现改进的基因枪技术会引起频繁的小范围重排，导致产生多个新的可读框，以及增加叶绿体 DNA 和外源基因共整合的频率。
本章列举了两例转基因事件，对不同的转基因方法加以说明。这两例事件采用的载体均为双元载体：选择性标记基因潮霉素基因和报告基因 β-葡萄糖醛酸酶基因位于同一个T-DNA 区。一个转化采用的是粒子轰击法（基因枪法，称为事件 1 ) ，另一个采用农杆菌介导转化方法（称为事件 2 ) 。为了确保其能在植物核基因组中顺利表达，外源基因的两端分别加上了启动子和终止子，同时假设其在质体基因组中不会发生插入和表达。
