蛋白质纯化之亲和层析法

一、仪器设备：

1.亲和层析管柱 （Bio-Rad 731-1550 Poly-Prep column, 0.8×4 cm）

2.部分收集器 （另需准备干净试管约25 支）

二、药品试剂：

1.金属螯合亲和层析胶体（Ni-NTA agarose, QIAGEN 30210）：1 mL。在交联琼脂糖凝胶上接有nitrilotriacetic acid （NTA） 官能基，可以螯合镍离子；使用前先以镍离子饱和的。

2.Buffer B-300/0（50 mM Na3PO4, pH 8.0; 0.3 M NaCl），使用前才添加成10 mM β-mercaptoethanol。

3.Buffer B-300/20：Buffer B-300/0 加有20 mM imidazole

4.Buffer B-300/250：Buffer B-300/0 加有250 mM imidazole

三、方法步骤：

1.亲和层析胶体1 mL 已经装填在管柱内，成为一淡蓝色胶柱。请把管柱架直在铁架上，去除下方的填塞物，用buffer B-300/0 流洗20 mL 后塞住出口，准备注入样本。

2.除去胶面上方的缓冲液，并取出样本 （IEX） 使其回到室温，慢慢用滴管加到亲和胶体上，小心勿弄乱胶体表面；让样本没入胶体中，同时收集流出液每管2.5 mL。

3.待样本全部进入胶体后，关闭出口，再慢慢加入buffer B-300/20，打开出口收集流出液；buffer B-300/20 共流洗30 mL。

4.接着以buffer B-300/250 流洗30 mL，方法同上，收集。

5.所有收集均定量蛋白质并测定酶活性，取收集酶活性最高的数个，共得 _______ mL （AF），保留100 μL 以供分析。