蛋白质纯化亲和层析法

若表达蛋白质上含有一段六个His 的片段，而亲和吸附胶上接有镍离子，此蛋白质会特异性地结合到吸着胶体；洗去杂质后可imidazole 洗脱目标蛋白质。（Pharmacia 操作手册， Affinity Chromatography）。

仪器设备：

亲和层析管柱 （Bio-Rad 731-1550 Poly-Prep column, 0.8×4 cm）

部分收集器 （另需准备干净试管约25 支）

药品试剂：

金属螯合亲和层析胶体 （Ni-NTA agarose, QIAGEN 30210） 1 mL

◆ 在交联琼脂糖凝胶上接有nitrilotriacetic acid （NTA） 官能基，可以螯合镍离子；使用前先以镍离子饱和的。

Buffer B-300/0 （50 mM Na3PO4, pH 8.0; 0.3 M NaCl）

◆ 使用前才添加成10 mM β-mercaptoethanol.

Buffer B-300/20: Buffer B-300/0 加有20 mM imidazole

Buffer B-300/250: Buffer B-300/0 加有250 mM imidazole

方法步骤：

1） 亲和层析胶体1 mL 已经装填在管柱内，成为一淡蓝色胶柱。请把管柱架直在铁架上，去除下方的填塞物，用buffer B-300/0 流洗20 mL 后塞住出口，准备注入样本。

2） 除去胶面上方的缓冲液，并取出样本 （IEX） 使其回到室温，慢慢用滴管加到亲和胶体上，小心勿弄乱胶体表面；让样本没入胶体中，同时收集流出液每管2.5 mL.

3） 待样本全部进入胶体后，关闭出口，再慢慢加入buffer B-300/20,打开出口收集流出液；buffer B-300/20 共流洗30 mL.

4） 接着以buffer B-300/250 流洗30 mL,方法同上，收集。

5） 所有收集均定量蛋白质并测定酶活性，取收集酶活性最高的数个，共得 _______ mL （AF），保留100 μL 以供分析。