蛋白质纯化实验相关问题

1、在进行一个蛋白纯化之前，应该对其蛋白有所研究，包括其性质，敏感性，例如该蛋白的溶解性，对高盐或pH敏感，是否容易氧化等；

2、需要考虑蛋白质的用途，来决定制备蛋白的量级规模，这就要考虑到层析柱的尺寸，得到的蛋白浓度如何，是否需要保持其活性以及避免不必要的污染物；

有关文献所描述的蛋白质和多肽的纯化方法一般都涉及手工或自动序列分析。当制备测序用蛋白样品时，需要注意以下一些问题，这些限制因素更多的可能与Edman降解测序法有关，而FAB质谱法也有其自身的污染等问题。

污染物主要来源于试剂中的多种小分子有机和无机化合物。为避免杂质对N末端的阻断，整个纯化过程中高品质试剂 （分析纯以上）以及采用温和反应条件是非常重要的。例如，如果尿素溶液中含有氰酸根离子，这些离子会与氨基反应而影响测序，而在高品质的尿素溶液中其含量较低。为了更谨慎起见，尿素溶液应在使用前配制，并经过离子交换树脂纯化。这些树脂均有商品，可由厂商 （如BDH 或Bio-Rad）提供。此外，加入20mmol/L的甲胺可能有助于测序，应避免使用一些会与氨基产生反应的试剂。

有一些可能会引起污染而应避免的小分子物质，其中含有伯胺的化合物通常是最麻烦的，经常会破坏整个测序分析。在一些利用载体吸附的固相测序中，这类物质会非常有效地与蛋白质和多肽竞争。而在其他自动和手动测序中，它们也会与 Edman降解试剂苯异硫氰酸酯反应，从而导致产率的降低，严重时会产生明显的重叠问题。一般序列重叠是由一次测序反应循环期间的部分反应引起的，这样从此次循环之后会产生交错的顺序，至少在随后的循环中会观察到两个相同的氨基酸。

最常见的氨基杂质可能是铵盐，特别是碳酸氢铵，该物质通常认为可通过冻干法完全除去，但是许多研究人员发现该方法不能达到完全去除的目的。其他一些应避免使用的常用化合物包括 Tris、嘧啶、甘氨酸、二羟乙基甘氨酸、氨基糖、多缓冲体系、两性电解质以及大多数的去污剂。虽然测序（特别是利用固相法测序）仍然要在这些物质存在的条件下进行，但污染的存在严重降低了测序程序的有效性。如果用 FAB-质谱分析样品，应该除去大多数盐，因为它们可能会与甘油以及常用于该技术的载体形成所不希望的加合物。大分子污染物 （如磷脂、碳水化合物和核酸）一般较少遇到，但是它们也会带来特定的问题，必须将其去除。

学问很多，比如裂解液其实有很多种，但除了适用范围还要注意是否需要添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，以防止其水解，而后两者又需要考虑适用范围和作用对象