过氧化物酶TMB法
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过氧化物酶
TMB
法
TMB法:原理同DAB法,但反应产物呈深蓝色沉淀。
1)孵育液配制
A液:亚硝基铁氰化钠(硝普钠) 100mg
H2
0 92.5ml
0.2mol/L醋酸缓冲液(pH 3.3) 5ml
B液:TMB 5mg
无水乙醇 2~4ml
临用前将A液和B液混合即为预孵育液。在每100ml预孵育液中加0.3%H2
02
1~ 5ml即为孵育液。
2)染色程序:
①组织固定于0.1mol/LPBS配制的3%戊二醛固定液中37℃ 30分钟;
②浸洗:用0.1mol/LPBS浸洗3次以上,每次15分钟或浸洗过夜,以除去内源性细胞色素C,抑制细胞色素氧化酶的夹杂反应;
③冰冻切片:厚5~15um;
④预孵育:切片人预孵育液中室温避光孵育20分钟,不断晃动切片;
⑤孵育:切片人孵育液中室温避光孵育10~20分钟,不断晃动切片;
⑥浸洗:将切片转移到0.2mol/L醋酸缓冲液(pH 3.3)中,0~4℃浸洗6次,每次30分钟;
⑦封片:甘油明胶封片。
3)结果:酶活性部位呈深蓝色沉淀。