过氧化物酶TMB法
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过氧化物酶
TMB
法
TMB法：原理同DAB法，但反应产物呈深蓝色沉淀。
1)孵育液配制
A液：亚硝基铁氰化钠(硝普钠) 100mg
H2
0 92．5ml
0．2mol/L醋酸缓冲液(pH 3．3) 5ml
B液：TMB 5mg
无水乙醇 2～4ml
临用前将A液和B液混合即为预孵育液。在每100ml预孵育液中加0．3％H2
02
1～ 5ml即为孵育液。
2)染色程序：
①组织固定于0．1mol/LPBS配制的3％戊二醛固定液中37℃ 30分钟；
②浸洗：用0．1mol/LPBS浸洗3次以上，每次15分钟或浸洗过夜，以除去内源性细胞色素C，抑制细胞色素氧化酶的夹杂反应；
③冰冻切片：厚5～15um；
④预孵育：切片人预孵育液中室温避光孵育20分钟，不断晃动切片；
⑤孵育：切片人孵育液中室温避光孵育10～20分钟，不断晃动切片；
⑥浸洗：将切片转移到0．2mol/L醋酸缓冲液(pH 3．3)中，0～4℃浸洗6次，每次30分钟；
⑦封片：甘油明胶封片。
3)结果：酶活性部位呈深蓝色沉淀。
