过氧化物酶DAB法

过氧化物酶 DAB 法

 

    过氧化物酶(peroxidase)与细胞 色素氧化酶具有相似的化学本质，是一类氧化还原酶，可使过氧化氢(H₂ O₂ )分解生成水和释放氧。过氧化物酶广泛分布于乳腺、甲状腺、唾液腺、肠上皮、血细胞和肥大细胞等。存在于细胞过氧化物酶体中，是机体的抗氧化酶，在防止氧代谢物损伤中具有重要作用。显示过氧化物酶常用联苯胺法。联苯胺如DAB和四甲基联苯胺(3，3，5，5，―tetramethyl benzidine,TMB)能被过氧化物酶分解过氧化氢产生的氧所氧化，形成有色多聚体沉淀，其中DAB被氧化为棕褐色沉淀，TMB被氧化为深蓝色沉淀。

 

    DAB法：过氧化物酶与过氧化氢作用产生游离氧，后者使无色的供氢体DAB氧化为棕褐色沉淀定位于过氧化物酶所在部位。

 

    1)孵育液配制

    DAB                                          5mg

    0．05mol/L Tris―HCl缓冲液(TNB，pH 7．6)     10ml

    1％H₂ 0：                                     0．1ml

 

    2)染色程序：

    ①组织固定于0．1mol/LPBS配制的3％戊二醛固定液中37℃ 30分钟；

    ②浸洗：用0．1mol/LPBS浸洗3次以上，每次15分钟或浸洗过夜，以除去内源性细胞色素C，抑制细胞色素氧化酶的夹杂反应；

    ③冰冻切片：厚5～15um；

    ④预孵育：切片人预孵育液(DABlomg溶于5ml蒸馏水后，加0．2mol/L、pH 6．5～7．0的PBS 5m1)室温孵育10―30分钟；

    ⑤孵育：切片人孵育液室温孵育5～10分钟；

    ⑥水洗：蒸馏水漂洗，亚甲蓝染核；

    ⑦封片：甘油明胶封片。

 

    3)结果：酶活性部位呈棕褐色沉淀。

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