细胞色素氧化酶二氨基联苯胺显示法(DAB法)
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细胞色素氧化酶(cytochrome oxidase,CCO)在细胞有氧呼吸中起重要作用,为线粒体膜固有酶,是线粒体标志酶之一,常作为细胞内氧化代谢指标。在含有大量线粒体的细胞内均有高强度细胞色素氧化酶活性。
3,3,
―二氨基联苯胺(3,3,
―diaminobenzidine,DAB)在细胞色素氧化酶的催化下,其侧链氨基被氧化,并进行反复氧化性聚合和氧化性环化,形成不溶性褐色吩嗪(phenazine)聚合体,DAB将氧化型细胞色素C还原,还原型细胞色素C又被细胞色素a再氧化。通过该循环的反复进行,DAB不断被氧化,反应氧化物沉积。DAB氧化物含有活性游离基,该游离基能使四氧化锇还原形成锇黑,故可在电镜下观察。
(1)孵育液配制
蒸馏水 5ml
3,3,
―二氨基联苯胺-4-盐酸盐 5mg
0.2mol/L磷酸缓冲液(pH 7.4) 5ml
过氧化氢酶C―100 lmg
细胞色素CⅢ型 10mg
(2)操作程序
①新鲜或固定组织冰冻切片,厚5~10um;
②孵育液中37℃孵育40~60分钟,充分洗涤;
③复染:亚甲蓝染核;
④甘油明胶封片。
(3)结果
酶活性部位呈棕褐色沉淀,细胞内线粒体数目多者酶活性强。
细肭色素氧化酶DBA法
大鼠骨骼肌纤维横断和纵断面中呈棕色为细胞色素氧化酶阳性反应
(4)对照实验
孵育液内加1mmol/L KCN或l0mmol/L NaN3
,反应完全呈阴性。抑制剂为氰化物、叠氮化钠(NaN3
)、硫化氢(H2
S)和一氧化碳,原因是这些物质均能与细胞 色素氧化酶的三价铁结合而抑制酶活性。从反应液中去掉底物DAB不能成为对照,因为DAB同时也是成色剂。