提问
提问
我要登录
|免费注册
点赞
收藏
wx-share
分享

PAS法显示细胞中糖类

相关实验:细胞中糖类显示实验

最新修订时间:

简介

PAS 法是动物组织内的多糖、黏多糖及黏蛋白常用的显示方法。

原理

PAS 法显示细胞中糖类的基本原理是过碘酸是一种氧化剂,能破坏各种结构内的 C-C键。含乙二醇基(CHOH-CHOH)的糖类在过碘酸的作用下氧化而产生双醛基(CHO-CHO),游离醛基与 Schiff 试剂中的无色品红反应,生成紫红色化合物而附着于含糖的组织上。过碘酸较组织学上常用的氧化 C-C 键的其他试剂(KMnO4、H2CrO4、H2O2)优越,因为它不再进一步氧化所产生的醛基,故醛基可与 Schiff 试剂反应生成紫红色化合物而得到定位。

材料与仪器

器材:


石蜡切片机、显微镜、常规实验器械、动物的肝、肾、心肌、骨骼肌或其他组织。


试剂:

①1%过碘酸

② Schiff 试剂

(碱性品红,1 g ;蒸馏水,200 mL ;1 mol / L HCI,20 mL ;偏重亚硫酸钠,1.0 g ;活性炭,2.0 g 。将1 g 碱性品红溶于200 mL 沸蒸馏水中,振荡5 min 使之溶解,冷却至50 ℃ 。过滤,并向滤液中加入20 mL 1 mol / L HCl。冷却至25 ℃ ,加入1.0 g 偏重亚硫酸钠,室温下暗处静置24 h 。加入2.0 g 活性炭,振荡1 min 。过滤。置棕色瓶密封,4 ℃ 保存。)

③0.5%偏重亚硫酸钠溶液

(10%偏重亚硫酸钠,5 mL ;1 mol / L HCl,5 mL ;蒸馏水,90 mL 。临用前混匀配制)

④乙酸酐-吡啶混合液

(乙酸酐,16 mL ;吡啶(无水),24 mL )

⑤1%淀粉糖化酶溶液

⑥ Carnoy 固定液

⑦苏木精染色液(苏木精,2.0 g ;95%乙醇,100 mL ;冰醋酸,10 mL ;纯甘油,100 mL ;钾明矾,3.0 g ;蒸馏水,200 mL 。具体配制方法如下:①将苏木精溶于25 mL 95%乙醇及冰醋酸中,然后加入甘油及剩余的乙醇;②钾明矾溶于水中,加热溶解;③把钾明矾溶液缓慢加入苏木精溶液中,边加边搅拌,混合后在光亮处放置3 周 左右;④过滤,备用)

步骤

PAS 法显示细胞中糖类的基本过程可分为如下几步:

(一)组织切片


A.取1~2 mm 厚的肝、肾、心肌、骨骼肌或其他组织块,用 Carnoy 固定液固定,置4 ℃ 冰箱2~4 h 。

B.标本经90%、95%、100%乙醇3次脱水,二甲苯透明,石蜡包埋。

C.切片脱蜡至蒸馏水。

D.入1%过碘酸水溶液2~5 min 。

E.蒸馏水洗。

F.Schiff 试剂浸泡15 min 。

G.0.5%偏重亚硫酸钠溶液浸泡3 次 ,每次2 min 。

H.流水冲洗5 min ,蒸馏水浸泡1 min 。

I.苏木精复染核。

J.流水冲洗5 min ,过蒸馏水,吸干。

K.95%、100%乙醇脱水各2 次 。

L.二甲苯透明,中性树胶封固。

2.对照片1(用乙酰作用阻断 PAS 反应)

A.于22 ℃ ,将对照片用乙酸酐-吡啶混合液处理1~24 h 。

B.水洗。

C.进行上述之 PAS 反应。

3.对照片2(淀粉糖化酶处理切片)

A.切片脱蜡至水,用1%淀粉糖化酶溶液(pH6.0)37 ℃ 下处理40 min(室温下处理60 min );或用唾液处理,室温下60 min(30 min 换1 次 ,共2 次 )。

B.流水洗5~10 min ,再蒸馏水洗。

C.进行上述之 PAS 反应。

注意事项

1.染色的程度取决于过碘酸处理的时间。因此,切片在过碘酸水溶液中处理时间不宜过长。


2.PAS 反应后,由于过碘酸氧化加速苏木精的染色,其染色时间可适当减少,常用苏木精稀染液复染。


来源:丁香实验

提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
关注公众号
反馈
TOP
打开小程序