PCR扩增样本DNA的HLA基因片段

一、PCR扩增体系

1. 1.0 uM 引物

2. 300 ng 待测样本基因组DNA

3. 2.0 U Taq多聚酶

4. 200 uM 各种dNTP

5. 用1×PCR缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH8.3，50 mM KCl，1.5 mM MgCl2，0.01%明胶）调至总体积100 ul，并用50 ul 矿物油覆盖，防止水分蒸发。

二、PCR扩增程序

按下列条件扩增30个循环，此程序适用于Perkin-Elmer9600扩增仪，其他型号扩增仪也可以参考。

1. 检测DR3、5、6、8

预变性：94℃，5分钟
变性： 94℃，30秒
退火： 60℃，50秒
延伸： 72，℃40秒

2. 检测DR2

预变性：94℃，5分钟
变性： 94℃，30秒
退火： 62℃，50秒
延伸： 72℃，40秒

3. 检测DR1

预变性：94℃，5分钟
变性： 94℃，30秒
退火： 55℃，50秒
延伸： 72℃，40秒

三、PCR扩增产物的鉴定

此步骤是监测PCR扩增的结果，预先用2%琼脂糖和1×TBE制备凝胶，每100 ml 凝胶中加入10 ul 溴化乙锭（10mg/ml），用梳子形成约10 ul 的加样孔，让凝胶完全凝固。

1. PCR扩增完毕后，吸取10ul的PCR反应液，置另一扩增管中；

2. 加入1~2 ul 的加样缓冲液（4%蔗糖，0.05%溴酚蓝）；

3. 20 V/cm 电泳；

4. 溴酚蓝移动7 cm 后停止电泳

5. 在紫外投射光下观察电泳结果并拍照。

PCR扩增后，电泳凝胶上应出现相应的PCR扩增产物条带。