免疫球蛋白提取 (Immunoglobulin isolation):Fab片段的制备方法
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利用胃蛋白酶分解 IgG ,将抗体断链为 Fab 和 Fc 片段。具体操作方法如下:
1 .将 IgG 粉末 100mg ,溶于 2ml0.10Mol/L pH4.0 醋酸缓冲液。溶液稍成白浊, 30 ℃ ,保温 10min 。
2 .取结晶胃蛋白酶 1.50mg ,溶于 1.50ml 0.10Mol/L pH4.0 醋酸缓冲液,加入上述溶液中,于 30 ℃ 作用 16h 。
3 .用 0.10Mol/L pH8.0 PBS 透析一夜。
4 .加入硫醇使成 0.10mol/L ,在室温下搅拌 30min 。
5 .加入 1Mol/L 的碘乙酰胺( Indoacetamide )使成为 0.10Mol/L ,室温下搅拌 1h 。
6 .用 0.01Mol/L PBS 1 000ml 透析过夜, 3 000r/min ,离心 30min ,去沉淀。
7 .以上清过 SephadexG100(40cm × 2.0cm ) 以 0.10Mol/L PBS 洗脱。
8 .以每管 6ml 收集,约在第 8 管开始, Fab 片段被洗脱。
9 .测 OD280nm ,将 Fab 管合并,浓缩、冻干。
10 .如制备 F(ab)2 ,上述 4 ~ 6 步骤则可以省略。