DNA片段的连接技术

一、目的与原理
DNA酶切片段的联接是两DNA片段相邻的5‘磷酸和3’羟基间可有连接酶催化形成磷酸二酯键，这个连接反应在体外一般都有大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶催化，但是分子生物学试验中主要采用T4DNA连接酶，因该酶在正常条件下，即能完成连接反应。本实验拟通过T4DNA连接酶对酶切片断的连接操作，掌握这一DNA片段的连接技术。
二、材料和方法
1． 仪器
离心机，恒温设备，真空干燥机，取液器
2． 试剂
T4DNA连接酶，10×T4DNA连接酶缓冲液、200mM Tris-HCl(pH7.6)、50mM MgCl2、50mM DTT、500μg/ml牛血清白蛋白、5mM ATP、λDNA、酚，TE缓冲液，电泳缓冲液、3M NaAc
三、操作步骤
取干净、灭菌新Eppendorf管，按下表加入各试液
试液 体积（μl）
T4DNA连接酶缓冲液 1.5
λDNA 10
ATP 1
无菌水 1.5
连接酶 1
总体积 15
19--20℃ 保温2小时，提取已连接好的DNA片段。电泳分析。
四、结果 （略）
五、注意事项
1、 该实验用的T4DNA连接酶最适反应是37℃，但该温度下DNA退火效率低，连接效率还不如22℃高。
2、 如果要检验连接酶和连接酶专用的缓冲液是否有效，可重新连接酶切后的λDNA。若连接成功，则说明有效。