DNA片段的连接技术

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目的与原理

DNA酶切片段的联接是两DNA片段相邻的5‘磷酸和3’羟基间可有连接酶催化形成磷酸二酯键，这个连接反应在体外一般都有大肠杆菌 DNA连接 酶和T4DNA连接 酶催化，但是分子 生物学试验中主要采用T4DNA连接酶，因该酶在正常条件下，即能完成连接反应。本实验拟通过T4DNA连接酶对酶切片断的连接操作，掌握这一DNA片段的连接技术。

二、材料和方法

1. 仪器

离心机 ，恒温设备，真空干燥机，取液器

2. 试剂

T4DNA连接酶，10×T4DNA连接酶缓冲液、200mM Tris-HCl(pH7.6)、50mM MgCl2、50mM DTT、500μg/ml牛血清白蛋白、5mM ATP、λDNA、酚，TE缓冲液，电泳缓冲液、3M NaAc

三、操作步骤

取干净、灭菌新Eppendorf管，按下表加入各试液

试液 体积(μl)

T4DNA连接酶缓冲液 1.5

λDNA 10

ATP 1

无菌水 1.5

连接酶 1

总体积 15

19--20℃ 保温2小时，提取已连接好的DNA片段。电泳分析。

四、结果 (略)

五、注意事项

1、 该实验用的T4DNA连接酶最适反应是37℃，但该温度下DNA退火效率低，连接效率还不如22℃高。

2、 如果要检验连接酶和连接酶专用的缓冲液是否有效，可重新连接酶切后的λDNA。若连接成功，则说明有效。