肝细胞原代培养
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11997
材料:
小鼠
器具:
饭盒、纱布、小剪子、小镊子、大镊子、大烧杯、平皿、研磨玻片、滤网、离心管(15/50ml)、6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器
试剂:
DMEM(含血清)、无血清DMEM培养基、胰酶、PBS
准备:
酒精擦拭台面后把物品摆放好,开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。
操作步骤:
1、将小鼠断颈致死,置75%酒精泡2-3秒钟,取肝脏,置于盛有PBS的平皿中。
2、剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物,转移到另一个盛有PBS液的平皿中。
3、用手术剪将脏器剪成小块(1mm2),玻片研磨,转到离心管,离心1000rpm,5min。
4、视组织或细胞量加入5-6倍(3-5ml)胰酶,37℃中消化20分钟,每隔5分钟振荡一次,或用吸管吹打一次,使细胞分离。
5、加入3-5ml含血清的培养液以终止胰酶消化作用。
6、用100目孔径滤网滤过,除去未消化的大组织块。
7、1000rpm,离心5分钟,弃上清液。
8、加入无血清培养液5ml,冲散细胞,再离心一次,弃上清液。
9、加入含血清的培养液l-2 ml(视细胞量),血球计数板计数。
10、将细胞调整到5×105/ml左右,转移至6孔培养板中,37℃下培养。