小鼠肝细胞的原代培养实验

一、 实验目的：通过直接消化法分离小鼠肝细胞进行原代培养，从而得到体外培养的小鼠肝细胞，进行相关实验研究。 二、主要实验步骤：

1、 将小白鼠引颈处死后于含有75%酒精的大烧杯中浸洗10秒钟。

2、 用剪刀剪开小鼠腹部,迅速取出肝脏并将其放入装有4℃的含双抗的D- Hanks 液中进行漂洗2次，之后在培养皿中用眼科剪子将鼠肝组织剪成1mm ³ 左右的小块, 放入试管中， 用吸管吹打, 待组织沉淀后吸出上清, 如此反复3 次,最后一次清洗后，将试管放入离心机800rp/min离心4min。

3、 将离心后的试管取出后弃上清， 加入10倍肝组织体积的含0.2% Ⅳ型胶原酶和1%PVP的消化液后，封口，4℃冰箱过夜。

4、 次日检查肝组织是否消化完全，消化完全者可用吸管吹打散开, 若消化不完全而吹打不开者,可重于37 ℃消化15min。

5、 将消化完全的悬液经200目不锈钢网过滤到培养皿中，之后将过滤后的悬液装到一个5ml 离心管 中，之后向过滤后的悬液中加入含10%新生牛血清的DMEM培养基到5ml, 于4℃冰箱中静置20min 。

6、 用吸管弃除悬液, 加入DMEM培养基至5ml, 以1000 转/ 分离心4min , 弃上清，如此反复3 次。

7、 最后离心完后再加入2ml含10%新生牛血清的DMEM完全培养基，收集肝细胞于培养瓶中，进行台盼蓝活 细胞计数 ；

8、 最后加入相同的完全培养基, 调整细胞密度至5×10 ⁵ /ml，于37℃、5%CO ₂ 条件下培养。

10 、 10h 后首次换液, 换以含50ml/L的新生牛 血清 的DMEM培养液, 以后每48h换液一次并依次降低胎牛 血清 含量至1%。