原代培养
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原理
原代培养是直接从生物体获取细胞进行培养，由于细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段，同时也为以后传代培养创造条件。最常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。组织块培养是将剪碎的组织块直接移植在培养瓶壁上，加入培养基后进行培养。分散细胞培养则是将组织块用机械法或化学法使细胞分散。从胎儿或新生儿的组织分离到活性最好的游离细胞，经典的方法是用蛋白水解酶(如胰蛋白酶和胶原酶)消化细胞间的结合物，或用金属离子螯合剂(如EDTA)除去细胞互相粘着所依赖的Ca2+，再经机械轻度振荡，使之成为单细胞。
材料与仪器
孕鼠(胚胎小鼠) 新生1～3天乳鼠
1640培养液 PBS 胰蛋白酶 EDTA混合消化液 乙醇
手术器械 平皿 培养瓶 吸管 离心管 煤气灯 烧杯 超净工作台 二氧化碳培养箱 倒置显微镜
1640培养液 PBS 胰蛋白酶 EDTA混合消化液 乙醇
手术器械 平皿 培养瓶 吸管 离心管 煤气灯 烧杯 超净工作台 二氧化碳培养箱 倒置显微镜
步骤
1. 取材
用颈椎脱位法使胎大鼠迅速死亡。然后，把整个动物浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀剪开用碘酒和乙醇再次消毒后的皮肤，剖腹取出肝脏或肾脏，置于无菌平皿中。
2. 切割
用灭菌的PBS 液将取出的脏器清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1 mm3 左右的小块，再用PBS 清洗，洗到组织块发白为止。移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。
3. 消化、接种培养
吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA 混合消化液1 ml，加入离心管中，与组织块混匀后，加上管口塞子，37 ℃水浴中消化8～10 分钟，每隔几分钟摇动一下试管，使组织与消化液充分接触，静止，吸去上清，向离心管中加入5～10 ml 含10％小牛血清的1640 培养基，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养。
注意事项
1. 严格进行动物皮肤消毒．使用三套器械取材。新生动物皮肤先用2％碘酊液消毒，成年鼠先用3％～5％碘酊液消毒后用75％乙醇消毒。
2. 严格进行无菌操作，防止细菌、真菌、支原体污染，避免化学物质污染。
3. 吸取液体前，瓶口和吸管进行火焰消毒；经火焰消毒后的吸管一定要用Hank’S液冷却。防止烫伤、烫死细胞。吸取液体时，避免瓶口和吸管接触碰撞。
4. 离心管入台前，管口、管壁应消毒。
常见问题
来源《中国医科大学实验指导手册》《分子生物学实验指导》
来源：丁香实验
