对比 Strep-tag® 与 His-tag 系统异同点？

无论是出于科研还是工业目的，成功的表达并且纯化所需的蛋白，都是进一步进行分析和研究的基础。在质上和量上有所不同，选择一个合适的纯化系统，来生产并纯化所需质和量的蛋白，值得慎重的考虑。一套合适的纯化系统，不仅可以节省时间和成本，更可以节省蛋白样品。

亲和层析法

将目的蛋白从其他细胞组分中纯化出来的方法多种多样。目前，最常用的方法之一是亲和层析法。

在其中，通常的方法是将目的蛋白与一段特殊的短肽或蛋白，也就是亲和标签所融合。这种亲和标签针对配体有特殊的亲和力。而配体可以是固定在层析基质上的其他蛋白质，小分子或是金属。当融合有亲和标签的蛋白通过标签-配体作用结合再层析基质上时，通过洗杂步骤，即可去除掉其他的细胞成分。

为了洗脱所需要的蛋白质，通过改变缓冲液的条件，如pH，或通过竞争亲和标签和配体连接的方法来进行。

但怎样的纯化是较为成功的呢？仅达到所需的质量量级，如毫克级（或克级）即可满足吗？

这些并不简单。质在蛋白纯化中同样尤为重要，比如，就蛋白的生物活性和纯度而言，通常会有所要求。

以下我们来讨论并且比较2种技术：

His-tag系统和Strep-tag®系统，都使用了亲和层析法来纯化得到所需的蛋白质，为目前所常用的技术方法。

His-tag系统有很高的蛋白产量(5–40 mg/ml resin)，但理想情况下的纯度约为80%左右。但如需在随后的分析中测量蛋白质的功能，就需要再进行更多的cleaning steps。

Strep-tag®系统一步纯化满足的纯度可达到95%，无需进行更多的纯化步骤即可直接进行蛋白的分析。产量数据为16 mg/ml。

深度对比Strep-tag®与His-tag系统

His-tag是以6个组氨酸残基组合的融合标签，其基于蛋白质表面的组氨酸残基侧链，在中性和弱碱性条件下可以和固定化的金属离子相互作用(如Ni离子，Zn离子，Co离子等)，从而达到纯化蛋白的目的。此系统的洗脱方式可以用过三种非特异性步骤达成：

1. 降低pH（4.5-6）
2. b. 加入EDTA

C.不同浓度咪唑溶液（20-250mM）

当蛋白洗脱完毕后，使用EDTA使纯化树脂与金属离子分离，即可完成树脂的再生。

Strep-tag®则是基于链霉亲和素(Streptavidin)和生物素这一自然的相互作用，将Strep-tag®II（WSHPQFEK）或Twin-Strep-tag®作为亲和标签（后者包含2个Strep-tag®II，中间加入spacer间隔开来）。这两种标签都可与改造后的链霉亲和素(Streptavidin)上的生物素结合位点相结合，通过使用脱硫生物素或生物素，即可将Strep-tag®标签蛋白洗脱下来。

由于His-tag系统具有吸附量大，性价比高，和可以在变性条件下进行蛋白纯化等优点，使其为大众所熟知。而Strep-tag®系统则可以获得高纯度的蛋白，但其同时也可以耐受多种缓冲液的使用。下面让我们对二者进行各项数据进行比较：

耐受的纯化条件

下表为His-tag 与 Strep-tag® 系统的耐受缓冲液对比

如果分离纯化膜蛋白或包涵体时，则纯化过程需要涉及到变性条件。

Strep-tag®系统最多允许的尿素浓度为6M，盐酸胍为1M，而His-tag 则为8M和6M。如若需要增加蛋白的溶解度，使用去垢剂，则两种系统均可兼容Triton-X100，Tween 20和Nonidet P40。

但不是所有的蛋白过表达后都在包涵体内，且膜蛋白仅占细胞表达蛋白的20%-30%。

因此，如果纯化过程需要考虑特殊的纯化条件，两种系统是都可以选择的。但如果比较其他的常规缓冲液，Strep-tag®系统则耐受的情况则更理想，其可兼容多种盐溶液，配体，金属离子，以及还原剂和螯合剂。

对比β-巯基乙醇或氯化钙来说，His-tag耐受的范围较小。而像Tris，HEPES或MOPS buffer 则不推荐在His-tag系统中使用，至于铵，DTT或EDTA则更需避免使用。但Strep-tag®系统可耐受以上提及的buffer 条件，通过配体或金属离子使目的蛋白保持稳定的状态，避免被蛋白酶降解或氧化过程中的损失。

因此Strep-tag系统的纯化可以被应用到更多类型蛋白中，如在金属蛋白的纯化。

如果对比两个系统耐受的pH值，Strep-tag®系统则耐受pH范围在4-10，在pH敏感蛋白的纯化选择上具有优势。His-tag系统不应该被使用在低pH条件的纯化中，在pH4.5-6的情况下，会导致蛋白的洗脱而造成流失。

表达宿主

在生产蛋白质过程中，宿主的选择十分重要，因其不仅影响蛋白的表达，而且也影响随后的纯化过程。除耐受缓冲液条件有限外，当选择宿主表达系统时，His-tag也有一些局限。

His-tag大肠杆菌表达系统中较为有利，但实际情况下对于酵母，哺乳动物和昆虫细胞表达系统，尤其是分泌蛋白的纯化中，His-tag系统则有局限。因为酵母和昆虫细胞的培养基pH通常为酸性，会干扰His-标签蛋白与IMAC纯化树脂的结合。而酵母和哺乳动物细胞培养基，则通常含有氨基酸会竞争His-标签的结合位点，如组氨酸，谷氨酰胺或精氨酸。

Strep-tag®系统对各宿主表达系统的适用情况较为理想。根据其纯化原理，酸性pH和有力的氨基酸不会影响Strep-标签蛋白与纯化树脂的结合（前文也曾提到，此系统的耐受pH范围为4-10）。而哺乳动物细胞培养基中存在的生物素需要注意，但实际上无需过多担心。因为其可通过添加适当封闭液进行封闭，且在Twin-Strep-tag®:Strep-Tactin®XT系统中不会产生影响。

如果考虑使用His-tag在酵母，昆虫或哺乳动物细胞中表达蛋白，在成本考量上还需加入后续的实验步骤，根据情况如透析，过滤，尺寸排阻或离子交换色谱等。

因此His-tag在量上的优势虽然很明显，但如核算总成本，“多快好省”仍是一种理想。

比较第三代Strep-tag®系统(右)与His-tag系统(左)在native条件下，纯化mCherry及GAPDH蛋白的效果

全面的考虑：质与量的选择

如果在选择纯化系统的选择上仍有疑虑，在下列表格中，全面对比了两种系统的各方面性质，希望可以帮助提供一些参考，如有需要可以收藏：

亲和力和特异性，将直接对纯化过程中蛋白挂柱的情况有影响。

His-tag系统的亲和力仅在nM - µM的范围内，会在导致过程中导致蛋白的流失。此外，由于His-tag抗体特异性较低，这会导致在使用检测过程中，检测到含有His残基的非特异性蛋白。

当进行类似分析等有高亲和力/高特异性抗体需求的实验应用时，如SPR或BLI，Strep-tag®技术则成为首选，因其µM-pM的亲和力范围赋予了较大优势。因此根据需要选择合适的纯化系统非常重要。

此外，由于不同的实验需求，需要多种多样的产品形式。Strep-tag®系统优点众多，历经长时间的发展，市面上已不仅有纯化填料可以选择，分析类实验的工具也日渐完善。

在各类文献中不难看到的有：标记了荧光染料的Strep-Tactin®XT偶联物/抗体，Strep-Tactin®XT包被板，和适用于SPR分析的Twin-Strep-tag® Capture Kit。