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分子克隆技术

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分子克隆技术通常特指基因克隆(gene cloning)或DNA重组技术(recombinant DNA technology)。基因克隆主要包括:①连接外源基因和克隆载体,构建重组DNA分子,②将重组DNA分子转入受体细胞,使外源基因随受体细胞分裂而得以复制、繁殖。
  一、基因克隆的基本方法
  质粒pBR322是一种典型的大肠杆菌克隆载体,它全长仅为4.3kb(通常,我们很难完整地分离和纯化长度超过50kb的DNA大分子)。pBR322带有两种抗生素抗性基因:b -内酰胺酶基因和四环素抗性基因,前者修饰并消除氨苄青霉素对大肠杆菌的毒性。通常,目的基因插入载体质粒将破坏四环素抗性功能。因此,使用含有氨苄青霉素和四环素的培养基,我们可以鉴别大肠杆菌的转化细胞:带有重组质粒的转化细胞只能在含氨苄青霉素、不含四环素的培养基上生长;另一方面,原受体细胞不能在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上生长;而有载体质粒但没有目的基因的转化细胞能在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上生长。另外,pBR322是一种松弛型质粒,在培养液中加入氯霉素可以使转化细胞中的质粒拷贝数由通常的15个增至1000-3000个,此间,大肠杆菌的染色体并不复制。
  酵母是基因克隆实验中常用的真核生物受体细胞,培养酵母菌和培养大肠杆菌一样方便。酵母克隆载体的种类也很多。其中,游离型质粒YEps(yeast episomal plasmids)、整合型载体YIps(Integrative yeast vectors)和人工染色体YACs(yeast artificial chromosomes)是三种最具代表性的酵母克隆载体。YEps是一种罕见的真核细胞质粒,大小2mm、长约6kb。YEps在细胞内的拷贝数为70-200个。YEps的性质和细菌质粒载体非常相似,唯一不同的是转化细胞的筛选方法。使用YEps时,主要通过受体细胞营养要求的变化鉴别转化细胞与受体细胞。由于利用YEps克隆的基因容易在细胞继代过程中丢失,因而,人们常用YIps替代YEps。不过,作为酵母菌的克隆载体,YIps的转化频率很低。另一方面,典型的YACs包括一个着丝点、两个端粒、一个复制起点和几个选择标记基因,是一个微型染色体。YACs主要用于克隆长基因或包括数个基因序列的基因组DNA片断。许多重要的动物基因往往含有多个内含子、占据相当长的DNA区域,而使用普通载体通常难以获得完整的基因序列克隆。
  构建基因文库的基本方法是:(1)将特定生物体的基因组DNA或互补DNA分解成适当长度的DNA片段,然后分别与克隆载体连接;(2)通过转化或转导的方法将带有不同DNA片段的重组DNA分子导入受体细胞,获得一套包含特定生物体所有DNA序列的克隆。成功构建基因文库的关键是选择合适的纯化、切断DNA的方法和克隆载体,使所获得的一套DNA序列克隆具有代表性、即不短缺任何DNA片段。例如,在构建基因组文库的过程中,如果某一段基因组DNA序列没能被克隆,那么,该基因组文库便不具有代表性。相似地,如果所建文库中没有足够数量的克隆,那么,肯定会有某些基因缺失。当然,一个完整的cDNA文库也只包括那些与mRNA互补的DNA序列,缺乏不转录的DNA序列。
目前,国际DNA数据库主要包括由欧洲生物信息研究所(EBI:European Bioinformatics Institute,英国剑桥)、美国国立生物技术信息中心(NCBI:National Center for Biotechnology Information,美国马里兰)和日本国立遗传学研究所(NIG:National Institute of Genetics,日本静冈)分别运营的EMBL数据库、GenBank数据库和DDBJ数据库组成。它们共同制定和采用相同的数据库管理程序,分别收集、整理并随时交换最新DNA序列信息,定期公布这些信息。此外,所有生物学国际权威性学术刊物都要求投稿者事先在国际DNA数据库登记拟发表的DNA、RNA或蛋白质氨基酸序列,据1999年3月DDBJ的统计数据(表5-1),国际DNA数据库纪录的DNA数据总量已由1967年的121个碱基对跃升为1999年的23亿个碱基对。
 

 

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