分子克隆常用技术

互联网2013-09-06

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一、核酸的纯化

　　在分子克隆的所有操作中，最基本的操作是核酸的纯化。其关键步骤是去蛋白质，通常只要用酚/氯仿。氯仿抽提核酸的溶液即可。每当需要把克隆有某一些所用的酶灭活或去除以便进行下一步时，可进行这种抽提。然而，如要从细胞裂解液等复杂的分子混合物中纯化核酸，则要先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白质后，再用有机溶剂抽提。这些广谱的蛋白酶包括链霉蛋白酶及蛋白酶K等，它们对多种天然蛋白均有活性，（1）用酚氯仿抽提：这两种有机溶剂合用，比单独用酚抽提的除蛋白效果更佳。继而用氯仿抽提则可除去核酸制品中的痕量酚。①核酸样品置有盖小离心管中，加入等体积的酚/氯仿。②旋涡混匀管内容物，使呈乳状。③12000× g 室温离心15秒。④水相移入另一离心管，弃去两相界面和有机相。⑤重复步骤①－④步操作，直至两相界面上见不到蛋白质为止⑦按下述核酸浓缩法沉淀回收核酸。

二、核酸的浓缩

　　应用最广的核酸浓缩法是乙醇沉淀法。在中等浓度单价阳离子存在下，加入一定量的乙醇后，所形成有核酸沉淀可经离心而回收，甚至对低至 pg 量的DNA或RNA，也可定量回收。回收的核酸可按所需浓度，再溶于适当的缓冲液中。
　　具体操作时，可向含样品的小离心管中加入 V/10 单价阳离子盐贮存液2 V 无水乙醇，混匀，放冰水浴中15 －30min ，取出目测平衡，0 －4度，12000g ，离心10 min 。吸弃上清，再另70%乙醇0.5 －1ml ，12000 g ，0 －4度洗涤离心2min 。吸弃上清，沉淀用油泵抽干或打开盖子晾干后，溶于适当体积的缓冲液中。

单价阳离子盐溶液

<center> <table> <tbody> <tr> <td> 　 　 </td> <td> 贮存液 (mol/L) </td> <td> 终浓度 (mol/L) </td> </tr> <tr> <td> (醋酸铵~8lt~J~Hfont~8gt~J~8lt~J~Hp~8gt~J~2~1~0~0~0~0~0~8lt~J~Htd~8gt~J~2~1~0~0~0~0~0~8lt~Jtd~8gt~J~2~1~0~0~0~0~0~0~8lt~Jp~8gt~J~2~1~0~0~0~0~0~0~0~8lt~Jfont~8gt~J7.5~8lt~J~Hfont~8gt~J~8lt~J~Hp~8gt~J~2~1~0~0~0~0~0~8lt~J~Htd~8gt~J~2~1~0~0~0~0~0~8lt~Jtd~8gt~J~2~1~0~0~0~0~0~0~8lt~Jp~8gt~J~2~1~0~0~0~0~0~0~0~8lt~Jfont~8gt~J2.0~8lt~J~Hfont~8gt~J_－2.5 </td> </tr> <tr> <td> LiCl </td> <td> 8.0 </td> <td> 0.8 </td> </tr> <tr> <td> NaCl </td> <td> 2.0 </td> <td> 0.2 </td> </tr> <tr> <td> 醋酸钠 </td> <td> 3.0（ pH 5.2 ) </td> <td> 0.3 </td> </tr> </tbody> </table> </center>

V/2 。

单价阳离子盐的选择，主要基于下述考虑：用醋酸铵可减少 dNTP 的共沉淀，但在以后要作核酸的磷酸化时应避免用醋酸铵，因铵离子是T，多核苷酸激酶的强烈抑制剂。当用较高浓度的乙醇沉淀RNA时，常用 LiCl ，因 LiCl 在乙醇中溶解度很高，不随核酸共沉淀。含有SDS的核酸样品，应使用 NaCl ，这时该去垢剂要70%乙醇中仍保持可溶。DNA和RNA沉淀，大多使用醋酸钠（ pH5.2 ）。

三、DNA、RNA的定量

　　准确的方法是紫外分光光度法。但本法要求核酸样品是纯净的（即无显著的蛋白质、酚、琼脂糖或其它核酸、核苷酸等污染物的制品）。用紫外分光光度计测定260 nm 和280 nm 两个波长处的光吸收，然后，按 IA260 相当于50μ g / ml 双链DNA。40μ g / ml 单链DNA或RNA及20μ g / ml 单链寡核苷酸。计算你的样品含量。260 nm 和 280nm 两处读数的比值（A260 / A280），可反映核酸的纯度。DNA和RNA纯品的A260/A280的值分别为1.8和2.0如果样品中有蛋白质或酚的污染，则A260/A280将明显低于此值，此时就无法对样品中的核酸进行精确定量。可将样品纯化后再作定量测定。有丰富实验室经验的人，仅凭样品电泳后溴化乙锭染色萤光带的强度，即可大致判断出样品中的核酸含量，故他们常不作核酸的紫外分光光度法定量。

四、核酸的凝胶电泳和分子量参照物

（一）琼脂糖凝胶电泳
　　可用于分离、鉴定和提纯DNA片段。本法操作简单、迅速，能分辨其它方法不能分开的DNA片段混合物，分开的DNA可用低浓度的萤光染料（0.5μ g / ml 溴化乙锭）染色，在紫外灯下直接观察检测少至 1ng 的DNA。
DNA通过琼脂糖凝胶的迁移率取决于以下参数：①DNA分子的大小：线奖双链DNA分子通过凝胶的速率与其分子量的常用对数成反比。据此用已知分子量的标准物质和待测分子量的DNA片段同时电泳，比较其电泳速率，即可求出待测片段的分子大小。②琼脂糖浓度：给定大小的DNA片段，以不同速度通过不同浓度的琼脂扩凝胶。因此利用不同浓度的凝胶，可分辨范围广泛，大小不同的DNA片段

不同浓度琼脂糖凝胶的分离范围

<center> <table> <tbody> <tr> <td> 浓度< %（ w/v ） </td> <td> 分离线状DNA分子的有关范围（ Kb) </td> </tr> <tr> <td> 0.3 </td> <td> 5-60 </td> </tr> <tr> <td> 0.6 </td> <td> 1-20 </td> </tr> <tr> <td> 0.7 </td> <td> 0.8-10 </td> </tr> <tr> <td> 0.9 </td> <td> 0.5-7 </td> </tr> <tr> <td> 1.2 </td> <td> 0.4-6 </td> </tr> <tr> <td> 1.5 </td> <td> 0.2-3 </td> </tr> <tr> <td> 2.0 </td> <td> 0.1-2 </td> </tr> </tbody> </table> </center>

③DNA构型：相同分子量的闭环（Ⅰ型），开环（Ⅱ型）和线状（Ⅲ型）DNA，以不同速率通过凝胶，一般情况下，迁移率Ⅰ型 > Ⅲ型 > Ⅱ型。④应用的电压：在低电压时，线状DNA片段的迁移率与所用电压成正比。但是压增高时，大分子量DNA片段迁移率的增大是不同的，因此琼脂糖凝胶的有效分离范围随电压增大而减小。为了获得DNA片段的最大分辨力，凝胶电泳时电压不应超过5 V/cm 。

（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳
　　可用于分析和制备小于1 Kb 长度的DNA片段

DNA在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围

<center> <table> <tbody> <tr> <td> 丙烯酰胺浓度 <%(w/v)> </td> <td> 有效分离范围（ bp ） </td> </tr> <tr> <td> 3.5 </td> <td> 100-1000 </td> </tr> <tr> <td> 5.0 </td> <td> 80-500 </td> </tr> <tr> <td> 8.0 </td> <td> 60-400 </td> </tr> <tr> <td> 12.0 </td> <td> 40-200 </td> </tr> <tr> <td> 20.0 </td> <td> 10-100 </td> </tr> </tbody> </table> </center>

聚丙烯胺凝胶多用垂直平板电泳，准备凝胶时，先配制30%单体母液（29克丙烯酰胺，1克双丙烯酰胺，加水溶解，定容至100 ml ），再用它来配制所需浓度的凝胶。每100 ml 上述液体加30μ l 四甲基乙胺（TEMED），混匀后即可灌注于予先准备好的洁净不渗漏的凝胶玻板，待凝胶灌至近顶端时，立即插入合适的“梳子”，放室温聚合60分钟，若冬天室温太低，则可放37度温温箱内，以促进聚合。聚合完成后，拔出“梳子”，将凝胶板固定于电泳槽中，向电泳槽倾入1×TBE，用滴管冲洗加样孔和凝胶底部以除去气泡，即可加样电泳。一般所用电压1-8 v / cm ，随时观察标记染米的迁移。在溶于1×TBE的聚丙烯酰胺中，标记染料迁移速率与下述DNA片段的速率相同

标记染料在PAG中的迁移~K~Hfont~M~K~Hp~M~2~1~Kdiv~M~2~1~0~8lt~Jcenter~8gt~J~2~1~0~0~8lt~Jtable~8gt~J~2~1~0~0~0~8lt~Jtbody~8gt~J~2~1~0~0~0~0~8lt~Jtr~8gt~J~2~1~0~0~0~0~0~8lt~Jtd~8gt~J~2~1~0~0~0~0~0~0~8lt~Jp~8gt~J~2~1~0~0~0~0~0~0~0~8lt~Jfont~8gt~J凝胶浓度（%） </td> <td> 溴酚蓝 </td> <td> 二甲苯腈蓝 </td> </tr> <tr> <td> 3.5 </td> <td> 100 </td> <td> 460 </td> </tr> <tr> <td> 5.0 </td> <td> 65 </td> <td> 260 </td> </tr> <tr> <td> 8.0 </td> <td> 45 </td> <td> 160 </td> </tr> <tr> <td> 12.0 </td> <td> 20 </td> <td> 70 </td> </tr> <tr> <td> 20.0 </td> <td> 12 </td> <td> 45 </td> </tr> </tbody> </table> </center>

bp 计）。电泳结束，从电槽中取出玻板并小心地撬开，凝胶浸于溴化乙锭液（0.5μ g/ml 1×TBE)染色，45 min 后放紫外灯下观察电泳结果。

（三）分子量参照物
　　为了判断目的DNA片段的大小，常在同一凝胶的目的DNA旁加一分子量参照物，同时电泳并染色后，就能在紫外灯下很快知道目的片段的大小。最常用的分子量参照物是 H ind Ⅲ消化物，各片段的大小以 bp 表示，分别为：23130，9416，6557，4361，2322，2027，564，125。