荧光素标记抗体

( 一 ) 　原理

 

　　目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素 (Fluorescein isothiocynate,FITC) 或罗达明 (Lissamine rhodamine B200, RB200) 。在硷性条件下 FITC 的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合，标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。

 

　　 ( 二 ) 　操作步骤

 

　　　　将纯化的 IgG 抗体对 PH9 ～ 9.5 碳酸盐缓冲液透析过夜，
　　　　透析后抗体液移入小烧杯中

 

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　　　　称取适量 IFTC ，加入二甲亚砜 (DMSO)(FITC ～ 1mg/1ml DMSO)
　　　　使终浓度为 1mgFITC ／ 1mlDMSO
　　　　 FITC ／ IgG 比例 : 如 IgG 浓度为 1mg ／ ml ， FITC ／ IgG 比例约为 50 μ gFITC ／ mgIgG ；
　　　　如 IgG 为 5 ～ 10mg ／ ml ，则比例为 25 μ gFITC ／ ml IgG
　　　　在 10ml 小烧杯中先放入抗体

 

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　　　　按上述比例将 FITC-DMSO 溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中

 

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　　　　将标记物用 PBS 加至 2.5ml ，磁力搅拌器室温下避光搅拌 2h

 

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　　　　用 PD10 柱 (Sephadex G25 柱 ) 除去游离荧光素，先用 25ml PBS 淋洗 G25 柱

 

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　　　　收集 PBS 洗脱第一个荧光素结合蛋白峰，测定 F ／ P
　　　　比值。第二个荧光素峰为游离荧光素

 

　　　　计算 :

 

　　　　　　　　　 2.87 × A495
　　　　 F ／ P ＝────────
　　　　　　　　 A280-0.35 × A495

 

　　　　合适的 F ／ P 值为 2 ～ 4 。

 

　　 ( 三 ) 　试剂器材

 

　　 1. 　纯化的多克隆抗体或单克隆抗体。

 

　　 2. 　 FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte) 或其它荧光色素。

 

　　 3. 　 PBS 、 DMSO

 

　　 4. 　 PH9 ～ 9.5 碳酸盐缓冲液 : Na₂ CO ₃ 4.3g ， NaHCO ₃ 8.6g 加蒸馏水至 500ml 。

 

　　 5. 　 PD10 柱 (Sephadex G25 柱 )

 

　　 6. 　磁力搅拌器，紫外分光光度计等

 

　　 ( 四 ) 　注意事项

 

　　 1. 　 FITC 保存于 4 ℃暗处，使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取，以避免潮解。

 

　　 2. 　 FITC-DMSO 液要临用时配制。

 

　　 3. 　碳酸盐缓冲液要新鲜配制。