原理
目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocynate，FITC）或罗达明（Lissamine rhodamine B200，RB200）。在碱性条件下FITC的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合，标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。
材料与仪器
抗体
FITC PBS DMSO 碳酸盐缓冲液
搅拌器 紫外分光光度计
FITC PBS DMSO 碳酸盐缓冲液
搅拌器 紫外分光光度计
步骤
1. 将纯化的IgG抗体对PH9～9.5碳酸盐缓冲液透析过夜，透析后抗体液移入小烧杯中
2. 称取适量IFTC，加入二甲亚砜（DMSO）（FITC～1 mg/1 ml DMSO），使终浓度为1 mgFITC/1 mlDMSO
FITC/IgG比例
如IgG浓度为1 mg/ml，FITC/IgG比例约为50 μgFITC/mgIgG；
2. 称取适量IFTC，加入二甲亚砜（DMSO）（FITC～1 mg/1 ml DMSO），使终浓度为1 mgFITC/1 mlDMSO
FITC/IgG比例
如IgG浓度为1 mg/ml，FITC/IgG比例约为50 μgFITC/mgIgG；
如IgG为5～10 mg/ml，则比例为25 μgFITC/ml IgG
在10 ml小烧杯中先放入抗体
3. 按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中
4. 将标记物用PBS加至2.5 ml，磁力搅拌器室温下避光搅拌2 h，用PD10柱（Sephadex G25柱）除去游离荧光素，先用25 ml PBS淋洗G25柱。收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰，测定F/P比值。第二个荧光素峰为游离荧光素。
计算：
合适的F/P值为2～4。
计算：
2.87×A495
F/P＝────────
A280-0.35×A495
合适的F/P值为2～4。
注意事项
1. FITC保存于4 ℃暗处，使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取，以避免潮解。
2. FITC-DMSO液要临用时配制。
3. 碳酸盐缓冲液要新鲜配制。
2. FITC-DMSO液要临用时配制。
3. 碳酸盐缓冲液要新鲜配制。
来源：丁香实验
