原理
酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。酶标记物中最常用的是酶标记抗体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。目前，高质量的酶（如辣根过氧化物酶，简称HRP）国内已有商品供应。高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。在制备方法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。
材料与仪器
抗体
戊二醛液 萘氏试剂 PBS NaIO4 碳酸盐缓冲液 醋酸钠缓冲液 NaBH4
搅拌器 分光光度计 离心机 透析袋 烧杯 试管 吸管
戊二醛液 萘氏试剂 PBS NaIO4 碳酸盐缓冲液 醋酸钠缓冲液 NaBH4
搅拌器 分光光度计 离心机 透析袋 烧杯 试管 吸管
步骤
一、酶制剂及其底物
凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用。但作为标记抗体用的酶应满足下列要求
1. 来源方便，易于纯化；
2. 比活性高，性质稳定；
3. 酶活性和量能用简单方法测定。
目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶（HRP）和硷性磷酸酶（AP），其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。
由于辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase， HRP）比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18 ％。HRP由多个同功酶组成，分子量为40000，等电点为PH3～9，酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶溶于水和58 ％以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403 nm和275 nm，一般以OD403 nm /OD275 nm的比值RZ（德文Reinheit Zahl）表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右（最高可达3.4）。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，纯度并不表示酶活性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。
HRP的催化反应需要底物过氧化氢（H2O2）和供氢体（DH2）。供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料（D）。酶促反应的过程如下
供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。如DAB（3，3－二氨基联苯胺）的反应产物为不溶性沉淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。5AS（5-氨基水杨酸）早期曾用于ELISA，但其溶解度不够大，且空白孔不易控制到无色，现已很少应用。OT（邻联甲苯胺）的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高，但反应中受温度影响较大，而且由于产物不稳定，需要在短时间内进行测定。目前用得较广泛和较满意的供氢体是：OPD（邻苯二胺）和TMB（四甲基联苯胺）。前者形成的产物为深桔黄色或棕色，后者产物为蓝绿色，二者的可溶性均好，在避光处颜色稳定，空白可近于无色，灵敏度上据报道后者比前者可高4倍以上。另外，还有一种供氢体称ABTS[2，2'-边氮基-双（3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸）]，其反应产物呈蓝绿色，且灵敏度和稳定性均好。尤其是在致癌的潜在可能性方面，ABTS与TMB皆是值得被优选的供氢体。
由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制剂，因此酶促反应中使用的H2O2不能过量。应控制在经较短时间反应后呈色即达高峰（说明H2O2已消耗殆尽）。这样即使再延长时间也不会增加反应产物的颜色。
二、HRP标记抗体的方法
酶与抗体交联的方法有许多种，根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP结合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。尤以简易过碘酸钠法更为常用。
1. 戊二醛二步法
②反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1 ml/1 分钟，收集棕色流出液。如体积大于5 ml，则以PEG浓缩至5 ml。放置25 ml小烧杯中，缓慢搅拌。
③将待标记的抗体12.5 mg用生理盐水稀释至5 ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。
④用1 M PH9.5碳酸缓冲液0.25 ml，继续搅拌3 小时。
⑤加0.2 M赖氨酸0.25 ml，混匀后，置室温2 小时。
⑥在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4 ℃1 小时。
（3）结果判定
本法是以NaIO4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，将近70 ％的HRP和Ig结合，99 ％的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重大损失，是目前最常用的方法。
（1）原理
经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的α-和ε氨基基以避免酶分子之间的交联。后来Wilson等改用在低PH下使NaIO4氧化HRP，从而省去了二硝基氟苯封闭HRP步骤。HRP经NaIO4氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏硷，后者可进一步用NaBH4（或乙醇胺）还原生成稳定的酶标记抗体。
（2）标记步骤
②于上液中加入0.2 ml新配的0.1 M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20 分钟。
③将上述溶液装入透析袋中，对1 mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4 ℃过夜。
④加20 μl 0.2 M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0～9.5，然后立即加入10 mg IgG（抗体，或SPA5 mg）在1 ml 0.01 M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2 小时。
⑤加0.1 ml新配的4 mg/ml NaBH4液，混匀，再置4 ℃ 2 小时。
⑥将上述液装入透析袋中，对0.15 M PH7.4 PBS透析，4 ℃过夜。
其余步骤（纯化）同戊二醛标记步骤的⑥、⑦、⑧。
（3）结果判定
IgG量（mg/ml）＝（OD280 nm-OD403 nm×0.3）×0.62
凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用。但作为标记抗体用的酶应满足下列要求
1. 来源方便，易于纯化；
2. 比活性高，性质稳定；
3. 酶活性和量能用简单方法测定。
目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶（HRP）和硷性磷酸酶（AP），其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。
由于辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase， HRP）比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18 ％。HRP由多个同功酶组成，分子量为40000，等电点为PH3～9，酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶溶于水和58 ％以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403 nm和275 nm，一般以OD403 nm /OD275 nm的比值RZ（德文Reinheit Zahl）表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右（最高可达3.4）。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，纯度并不表示酶活性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。
HRP的催化反应需要底物过氧化氢（H2O2）和供氢体（DH2）。供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料（D）。酶促反应的过程如下
HRP
DH2＋H2O2────→D＋2H2O
供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。如DAB（3，3－二氨基联苯胺）的反应产物为不溶性沉淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。5AS（5-氨基水杨酸）早期曾用于ELISA，但其溶解度不够大，且空白孔不易控制到无色，现已很少应用。OT（邻联甲苯胺）的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高，但反应中受温度影响较大，而且由于产物不稳定，需要在短时间内进行测定。目前用得较广泛和较满意的供氢体是：OPD（邻苯二胺）和TMB（四甲基联苯胺）。前者形成的产物为深桔黄色或棕色，后者产物为蓝绿色，二者的可溶性均好，在避光处颜色稳定，空白可近于无色，灵敏度上据报道后者比前者可高4倍以上。另外，还有一种供氢体称ABTS[2，2'-边氮基-双（3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸）]，其反应产物呈蓝绿色，且灵敏度和稳定性均好。尤其是在致癌的潜在可能性方面，ABTS与TMB皆是值得被优选的供氢体。
由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制剂，因此酶促反应中使用的H2O2不能过量。应控制在经较短时间反应后呈色即达高峰（说明H2O2已消耗殆尽）。这样即使再延长时间也不会增加反应产物的颜色。
二、HRP标记抗体的方法
酶与抗体交联的方法有许多种，根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP结合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。尤以简易过碘酸钠法更为常用。
1. 戊二醛二步法
（1）原理
戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。
戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。
（2）标记步骤
①称取HRP25 mg溶于1.25 ％戊二醛溶液中，于室温静置过夜。
②反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1 ml/1 分钟，收集棕色流出液。如体积大于5 ml，则以PEG浓缩至5 ml。放置25 ml小烧杯中，缓慢搅拌。
③将待标记的抗体12.5 mg用生理盐水稀释至5 ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。
④用1 M PH9.5碳酸缓冲液0.25 ml，继续搅拌3 小时。
⑤加0.2 M赖氨酸0.25 ml，混匀后，置室温2 小时。
⑥在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4 ℃1 小时。
⑦3000 rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15 M PH7.4的PBS中。
⑧将上述溶液装入透析袋中，对0.15 M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后（用萘氏试剂检测），10000 rpm离心30 分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。
⑧将上述溶液装入透析袋中，对0.15 M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后（用萘氏试剂检测），10000 rpm离心30 分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。
（3）结果判定
①定性及效价滴定
用特异性抗原（或抗体）同酶标记抗体（或抗免疫球蛋白抗体）作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA法（或在正式实验系统里）对酶结合物进行滴定。
用特异性抗原（或抗体）同酶标记抗体（或抗免疫球蛋白抗体）作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA法（或在正式实验系统里）对酶结合物进行滴定。
②定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定（光程1 cm）。
酶量（mg/ml）＝OD403 nm×0.4
IgG量（mg/ml）＝OD280 nm-OD403 nm×0.42×0.94×0.62
酶量（mg/ml） IgG量（mg/ml） 酶量
克分子比值＝──────── ÷ ─────── ＝ ─── × 4
40000 160000 IgG量
③本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2～4 ％的酶与蛋白质结合。
2. 简易过碘酸钠法
本法是以NaIO4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，将近70 ％的HRP和Ig结合，99 ％的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重大损失，是目前最常用的方法。
（1）原理
经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的α-和ε氨基基以避免酶分子之间的交联。后来Wilson等改用在低PH下使NaIO4氧化HRP，从而省去了二硝基氟苯封闭HRP步骤。HRP经NaIO4氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏硷，后者可进一步用NaBH4（或乙醇胺）还原生成稳定的酶标记抗体。
（2）标记步骤
①称取5 mgHRP溶解于1 ml蒸馏水中。
②于上液中加入0.2 ml新配的0.1 M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20 分钟。
③将上述溶液装入透析袋中，对1 mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4 ℃过夜。
④加20 μl 0.2 M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0～9.5，然后立即加入10 mg IgG（抗体，或SPA5 mg）在1 ml 0.01 M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2 小时。
⑤加0.1 ml新配的4 mg/ml NaBH4液，混匀，再置4 ℃ 2 小时。
⑥将上述液装入透析袋中，对0.15 M PH7.4 PBS透析，4 ℃过夜。
其余步骤（纯化）同戊二醛标记步骤的⑥、⑦、⑧。
（3）结果判定
除标记物IgG量的计算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。
IgG量（mg/ml）＝（OD280 nm-OD403 nm×0.3）×0.62
注意事项
1. 在具备高质量HRP的条件下，所要标记的抗体也要活性高，效价高（最低1∶16），纯度高，亲和力好，这是保证标记物效价高，免疫活性好的首要条件。
3. 室温搅拌时须避光，室内温度一般在25 ℃为宜。标记物每次透析前，须认真检查，防止漏液。
4. 浓的标记物相当稳定，常加入30～40 ％甘油于-10 ℃下保存。4 ℃可保存1～2 年，但稀释成1∶10，只能保存数周。已配制的使用液应在12 小时内用完。切忌反复冻融。
2. 所使用试剂的PH和浓度及用量必须严格掌握。所用试剂，最好（或必需）新鲜配制。如在戊二醛标记法中所用戊二醛应为新鲜纯品，因戊二醛储存过久可形成缩和体（杂质）。否则，影响标记效果。
3. 室温搅拌时须避光，室内温度一般在25 ℃为宜。标记物每次透析前，须认真检查，防止漏液。
4. 浓的标记物相当稳定，常加入30～40 ％甘油于-10 ℃下保存。4 ℃可保存1～2 年，但稀释成1∶10，只能保存数周。已配制的使用液应在12 小时内用完。切忌反复冻融。
常见问题
一、工作浓度的选择
在免疫酶技术中，首先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。因为酶标记物浓度的很小变化，便可导致试验结果产生很大的波动。另外，由于浓度过高，可使非特异性反应增加，而浓度过低又可影响测定的敏感性。因此，正式试验前必须准确滴定其工作浓度。
1. 酶标记抗体的滴定方法
将抗原（或抗体）物理吸附于固相载体上，然后将经过一系列稀释的酶标抗体（或抗Ig抗体）与吸附在载体上的抗原（或抗体）起反应，以酶与底物的显色反应程度来确定酶标记抗体的效价，或称工作浓度。
2. 步骤
先将抗原（或抗体）用0.05 M PH9.6包被缓冲液稀释为10 μg/ml左右，于聚苯乙烯板孔内加0.1 ml，4 ℃过夜，次日以洗涤缓冲液洗涤3次。酶标记抗体用1 ％BSA-PBS液依次稀释成1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600......（根据据抗体的滴度而定），分别加入反应孔中，每个稀释度二孔，每孔0.1 ml，37 ℃孵育1小时后洗涤。然后加底物液，每孔0.1 ml，37 ℃10～30 分钟。以2 M H2SO4 0.05 ml终止反应。
3. 结果判定
主要以ELISA比色仪读取各孔OD值。并以OD为纵座标，结合物浓度为横座标，绘制滴定曲线。由曲线上查得OD值为1.0左右，且曲线斜率最大时的酶标抗体稀释度，即为该标记物的工作浓度。
5. 要说明的是，本法为ELISA直接法，所测的工作浓度与在实际应用中的最适浓度可相差几个滴度。这就要求在建立ELISA实验系统中，因此基础上还应进一步确定实际工作浓度（可采用方阵法），以达到最适的实验条件。
在免疫酶技术中，首先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。因为酶标记物浓度的很小变化，便可导致试验结果产生很大的波动。另外，由于浓度过高，可使非特异性反应增加，而浓度过低又可影响测定的敏感性。因此，正式试验前必须准确滴定其工作浓度。
1. 酶标记抗体的滴定方法
将抗原（或抗体）物理吸附于固相载体上，然后将经过一系列稀释的酶标抗体（或抗Ig抗体）与吸附在载体上的抗原（或抗体）起反应，以酶与底物的显色反应程度来确定酶标记抗体的效价，或称工作浓度。
2. 步骤
先将抗原（或抗体）用0.05 M PH9.6包被缓冲液稀释为10 μg/ml左右，于聚苯乙烯板孔内加0.1 ml，4 ℃过夜，次日以洗涤缓冲液洗涤3次。酶标记抗体用1 ％BSA-PBS液依次稀释成1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600......（根据据抗体的滴度而定），分别加入反应孔中，每个稀释度二孔，每孔0.1 ml，37 ℃孵育1小时后洗涤。然后加底物液，每孔0.1 ml，37 ℃10～30 分钟。以2 M H2SO4 0.05 ml终止反应。
3. 结果判定
主要以ELISA比色仪读取各孔OD值。并以OD为纵座标，结合物浓度为横座标，绘制滴定曲线。由曲线上查得OD值为1.0左右，且曲线斜率最大时的酶标抗体稀释度，即为该标记物的工作浓度。
4. 有关试验的试剂及器材均见ELISA部分。
5. 要说明的是，本法为ELISA直接法，所测的工作浓度与在实际应用中的最适浓度可相差几个滴度。这就要求在建立ELISA实验系统中，因此基础上还应进一步确定实际工作浓度（可采用方阵法），以达到最适的实验条件。
来源：丁香实验
