用荧光素标记抗体

【试剂及配制】

（1）0.025mol/L pH9.0碳酸盐缓冲液（CB）

NaHCO3 2.10g

Na2 CO3 0.16g

蒸馏水加至 1000ml

（2）0.5mol/L pH9.5 碳酸盐缓冲液（CB）

NaHCO3 3.70g

Na2 CO3 0.6g

蒸馏水加至 100ml

（3）0.01mol/L pH7.2 PBS

Na2 HPO4 ?12H2 O 2.58g

NaH2 PO4 ?2H2 O 0.44g

NaCl 8.50g

蒸馏水加至 1000ml

（4）Sephadex G-25（或G-50）柱（1.2×30cm）

（5）抗体

（6）荧光素：FITC（或TRITC）

【操作方法】

下面介绍直接法和半透膜法。

1、直接法（Marshall法）

（1）取适量纯化的抗体，用0．025mol/L pH9.0 CB将抗体溶液的蛋白浓度稀释至20mg/ml，将溶液放置冰浴内；

（2）取相当于抗体蛋白1/100的FITC（或相当于1/30-1/40的TMRITC）溶于抗体溶液量1/10的0.5mol/L pH9.5 CB中（该溶液不稳定，2 h内应用）；

（3）在电磁搅拌器缓慢搅拌下将FITC（或TRITC）缓慢滴入抗体溶液中，注意避免产生气泡，约在5-10min内加完；

（4）将容器加塞密闭后，连同电磁搅拌器移置于4℃，继续缓慢搅拌，使荧光素与抗体结合（偶联）12-18h（温度升高，时间缩短。如在20-25℃室温下，搅拌结合只需2-4h）。用TMRITC标记时，反应时间为18h；

（5）将偶联物经离心沉淀（3000r/m×20min）去除少量沉淀物，取上清夜置透析袋内，先用流水透析5min后，再用大量0.01mol/L pH7.2 PBS于4℃透析4h。一般PBS的用量为标记物的100倍；

（6）准备Sephadex G-25（或G-50）柱（1.2×30cm），用0.01mol/L pH7.2 PBS流洗平衡，尔后上样。一般上样量小于柱床容积的1/2。1.2×30cm柱床容积为33.9ml，上样量不大于15ml。也有人认为应为1/6-1/10；

（7）用0.01mol/L pH7.2 PBS洗脱，搜集第一洗脱峰，合并后即为荧光抗体。在必要时，可用DEAE-纤维素层析法去除过度标记的蛋白，并可用免疫吸附法去除非特异性抗体或交叉抗体。

2、半透膜法（Clark 法）

（1）用0.025mol/L pH9.0 CB将待标记的抗体蛋白稀释为10mg/ml，装入透析袋内。将口袋扎紧，仅留少许空隙；

（2）用相同缓冲液将FITC配成0.1mg/ml溶液，需要量为抗体溶液体积的10倍。盛于烧杯内；

（3）将透析袋浸没于FITC液内，放4℃；

（4）在电磁搅拌器缓慢搅拌下，结合18-24h后取出，标记过程即告完成；

（5）吸取透析袋内结合物，用Sephadex G-25（或G-50）柱层析（同上），去除游离荧光素。

【注意事项】

（1）影响标记的因素主要有温度、时间、pH及荧光素与抗体蛋白的量等。标记所需的时间与温度呈反比，4℃需12-18h，20-25℃需2-4h；PH低，标记慢，但如pH大于10，抗体易变性，故pH以9.0-9.5为宜；抗体蛋白量低标记慢，以20mg/ml为宜；荧光素如使用FITC无定型粉末时，用量可稍大，如为结晶型，用量则应减少。

（2）标记抗体中如存在2×10-5 mg/ml游离荧光素时即可产生非特异性荧光，故用Sephadex凝胶柱过滤时，上样量不宜太多，一般上样量小于柱床容积的1/2。

（3）免疫血清中的白蛋白易与荧光素结合，在每ml抗体溶液中白蛋白量为6.25×10-2 mg/ml时，即可出现非特异性荧光。故待标记的抗体以用纯化的抗体为好。

（4）半透膜法（Clark 法）适用于小量抗体的标记。标记效果比直接法均匀，非特异性染色较少，结合物中游离荧光素含量较低，易于彻底去除，但该法荧光素用量较大。

（5）用过的Sephadex凝胶柱常附有荧光素而难于除尽，可使用0.1mol/L HCl处理0.5h，再依次用蒸馏水、PBS流洗，平衡