​荧光素标记抗体

荧光标记抗体方法有直接标记法和间接标记法两种。

(1) 直接法：较为常用，具体步骤是：

1) 抗体溶液的制备：用 0.01mol/L pH 7.1 PBS 将待标记抗体稀释至 20mg/ml;

2) 荧光素：根据待标记抗体的总量，按 0.01mg 荧光素/mg 蛋白，将荧光素溶解于 0.5mol/L pH 9.5 碳酸盐溶液中，体积为抗体溶液的 1/10;

3) 标记：于4℃条件下，抗体溶液放置在磁力搅拌机上，将荧光素逐滴缓慢加入，同时保持反应液pH 值在8.5左右，如此连续搅拌反应 4～6h。应尽量避免产生泡沫，避免将荧光素粘在容器壁及搅拌棒上；

4) 透析：标记后的抗体溶液 2500r/min 离心 20min, 取上清在 10～50 倍体积的 pH 8.0 PBS中透析2～4h;

5) 标记抗体的纯化： Sephadex G-50 凝胶过滤去除游离荧光素。本法标记均匀，重复性好，极少产生非特异性荧光，蛋白质也少变性，荧光亮度好，保存时间长。

(2) 间接法：

1) 抗体溶液的制备：用 0.025mol/L pH 9.5 PBS将待标记抗体稀释至10mg/ml, 装入透析袋中；

2) 荧光素溶液的配制：根据待标记抗体的总量，按 0.05mg 荧光素/mg蛋白称取荧光素，溶解于0.025mol/L pH 9.5 碳酸盐溶液中，体积是抗体溶液的 10 倍；

3) 标记：将透析袋浸泡于荧光素溶液中， 4℃磁力搅拌 16～18h;

4) 标记抗体的纯化： Sephadex G-50 凝胶过滤去除游离荧光素。