病毒免疫荧光实验

1.病毒染色标本的制备2.荧光抗体的制备3.​荧光素标记抗体4.荧光抗体染色

1. 培养细胞小玻片标本的制备 根据所检测病毒种类，选择敏感细胞进行培养，如乙型肝炎病毒用乳地鼠肾细胞 (BHK21 细胞）培养，森林脑炎病毒用绿猴肾细胞 (Vero 细胞）培养，登革热病毒用白纹伊蚊传代细胞 (C6/36 细胞）培养。按细胞培养方法，将其分装在有盖玻片的培养板或培养瓶中，置 37℃温箱培养成单层细胞，然后接种病毒。接种病毒量及培养时间因病毒种类而异。如乙型肝炎病毒接种的病毒滴度为

荧光色素的选择 可以产生明亮荧光的染料物质，称荧光色素 (fluorochrome) 。目前常用的荧光色素有以下几种：(1) 异硫氰酸荧光素 (Fluorescein isothiocyanate, FITC): 在碱性条件下， FITC 的异硫氰酸基在水溶液中与免疫球蛋白的自由氨基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键，成为标记荧光免疫球蛋白，即荧光抗体。一个 Ig分子上最多能标记 15-20个FITC 分

荧光标记抗体方法有直接标记法和间接标记法两种。(1) 直接法：较为常用，具体步骤是：1) 抗体溶液的制备：用 0.01mol/L pH 7.1 PBS 将待标记抗体稀释至 20mg/ml;2) 荧光素：根据待标记抗体的总量，按 0.01mg 荧光素/mg 蛋白，将荧光素溶解于 0.5mol/L pH 9.5 碳酸盐溶液中，体积为抗体溶液的 1/10;3) 标记：于4℃条件下，抗体溶液放置在磁力搅拌

荧光抗体染色按不同反应机制，可有以下几种：1.直接法 用已知特异性病毒抗体与荧光素结合，制成荧光特异性抗体，直接与细胞或组织中相应病毒抗原结合，在荧光显微镜下即可见病毒或病毒抗原存在部位呈现特异性荧光。此法特异简便，但一种荧光抗体只能检查一种抗原，特异度较高，敏感性较差。具体方法如下：①染色：将（一）中制成的病毒染色标本，滴加染色效价为1:8 或 1:16 的荧光抗体，室温或 37℃湿盒内放置 3