荧光抗体染色

荧光抗体染色按不同反应机制，可有以下几种：

1.直接法 用已知特异性病毒抗体与荧光素结合，制成荧光特异性抗体，直接与细胞或组织中相应病毒抗原结合，在荧光显微镜下即可见病毒或病毒抗原存在部位呈现特异性荧光。此法特异简便，但一种荧光抗体只能检查一种抗原，特异度较高，敏感性较差。

具体方法如下：①染色：将（一）中制成的病毒染色标本，滴加染色效价为1:8 或 1:16 的荧光抗体，室温或 37℃湿盒内放置 30min;

②洗片：倾去存留的荧光抗体，将切片浸入 pH 7.4 或 7.2 的 PBS 中洗 2次，每次 5min, 再用蒸馏水洗 1min

③用 50% 甘油 (0.5mol/L pH 9.5 碳酸缓冲液稀释)封固，镜检。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“十”表示：（－）无荧光；（士）极弱的可疑荧光；（十）荧光较弱，但清楚可见；（＋＋）荧光明亮；（＋＋＋～＋＋＋＋）荧光亮度最强。待检标本特异性荧光染色强度达"++"以上，而各种对照显示为（士）或（一），即可判定为阳性。

2 间接法 利用间接法可检测未知抗原或未知抗体。先用已知未标记病毒抗体（第一抗体）加在含未知抗原的标本上，或用未知未标记抗体（第一抗体）加在已知的病毒抗原标本上，抗原抗体结合后，除去未结合抗原和抗体，再加人荧光抗体（荧光素标记的第二抗体，即如果第一抗体来自人血清，那么第二抗体就是用人类免疫球蛋白 IgG 免疫兔子或山羊获得的抗 IgG 抗体，然后用荧光素标记的第二抗体），荧光抗体与第一抗体结合，形成抗原－抗体－荧光抗体的复合物，而间接地显示出组织和细胞中抗原或抗体的存在。优点是可用以鉴定未知抗原或抗体，用一种标记的第二抗体，能检测各种抗原抗体复合物，敏感性高。缺点是参加反应的组分较多，受干扰的机会也多，方法较繁琐，费时，需要设置较多的对照。

具体方法如下： ①将（一）中制成的病毒染色标本，置于染色湿盒内；

②滴加 0.01mol/L,pH7.4 的PBS于已知抗原标本片，10 min后弃去，使标本片保持一定湿度；

③滴加未标记的特异性抗体于标本片，37℃作用 30min;

④0. 01mol/L pH 7.2 PBS 洗2次，每次5min,吹干；

⑤滴加特异性荧光抗体于标本片，37℃作用 30min;

⑥如④水洗；

⑦缓冲甘油封固，镜检。

3. 补体法 在抗原抗体反应时加入补体，再用荧光标记的抗补体抗体（如抗C₃) 与补体结合形成抗原－抗体－补体－抗补体复合物，在荧光显微镜下呈现阳性荧光的部位就是免疫复合物的存在处。此法敏感性高，仅需一种荧光标记的抗补体抗体，即可检测所有能结合补体的抗原抗体系统。缺点是容易出现非特异性着色，此外补体不稳定，每次均需采取新鲜血清，操作较繁琐。

具体方法如下： ①吸取经适当稀释的免疫血清和补体的等量混合液滴在（一）中制成的病毒染色标本，31℃湿盒内放置 30min;

②用 0.01 mol/L pH 7.2 PBS 洗2次，搅拌，每次 5min, 吸干标本周围水液；

③滴加经过适当稀释的抗补体荧光抗体，37℃放置 30min

④同②洗涤；

⑤蒸馏水洗1 min, 缓冲甘油封固，镜检。

（一）对荧光抗体的稀释度应适当，过浓易出现非特异性染色，过稀会降低特异荧光亮度，甚至出现假阴性。

（二）已知抗原标本片需在操作的各个步骤中始终保持湿润，避免干燥。

（三）所滴加的待检抗体标本或荧光标记物，应始终保持在已知抗原标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色。

（四）染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般 30 min 已足够。

（五）封片时应防止产生气泡。

（六）荧光染色后一般在1h 内完成观察或于 4℃保存 4 h,时间过长会使荧光减弱。

（七）为排除非特异性荧光，试验时必须设置以下对照：

1. 直接法： (1) 标本自发荧光对照：标本只加入 PBS 应无自发荧光； (2) 阻断试验：标本先加未标记特异性抗体，再加标记荧光抗体，结果应为阴性； (3) 阳性对照：用已知阳性抗原作荧光染色，应呈阳性。

2. 间接法 心标本自发荧光对照；(1)荧光抗体对照：标本只加荧光抗体染色，结果应为阴性；(2)阻断试验：先加第一抗体，再加未标记的第二抗体，最后加标记的第二抗体，结果应为阴性；(3)阳性对照：用已知特异性抗体与相应抗原结合，再加荧光抗体，结果应为阳性；(4)阴性对照：用已知阴性材料代替第一抗体，经荧光染色后应为阴性。以上结果完全正确，正式实验才能确定结果。此后每批实验都设阴性和阳性对照，以确保实验的准确性。

3. 补体法：除设有阴性、阳性对照外，还应设不加补体的对照，不加抗血清的对照。