冰冻切片和石蜡切片的免疫组化染色步骤及荧光抗体染色方法

速冻组织

　　将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内（直径2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮内，大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。取出组织冰块立即置入-80℃冰箱储存备用，或置于恒冷切片机冰冻切片。

　　冰冻切片4~8mm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。

　　室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟。也可根据需要选择其它的固定方式。

　　PBS洗，5分钟×3。

　　用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。

　　PBS洗，5分钟×3。

　　下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤（滴加一抗开始）。

石蜡切片免疫组化染色步骤

三步法（以SP试剂盒为例）

　　1. 石蜡切片脱蜡至水。

　　2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。

　　3. 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2分钟×3次。

　　4. 5~10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。

　　5. PBS冲洗，2分钟×3次。

　　6. 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。

　　7. PBS冲洗，2分钟×3次。

　　8. 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。

　　9. PBS冲洗，2分钟×3次。

　　10. 显色剂显色（DAB或AEC）。

　　11. 自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。

二步法（以PV-9000通用型二步法检测试剂盒为例）

　　1. 石蜡切片脱蜡至水。

　　2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。

　　3. 3% H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2分钟×3次。

　　4. 滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。

　　5. PBS冲洗，2分钟×3次。

　　6. 滴加试剂1（Polymer Helper），室温或37℃孵育20分钟，PBS或TBS冲洗，2分钟×3次。

　　7. 滴加试剂2（poly peroxidase-anti-mouse/rabbit IgG），室温或37℃孵育20~30分钟，PBS或TBS冲洗，2分钟×3次。

　　8. PBS冲洗，2分钟×3次。

　　9. 显色剂显色（DAB或AEC）。

　　10. 自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。