冰冻切片和石蜡切片的免疫组化染色步骤及荧光抗体染色方法
丁香实验
一、速冻组织
将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内(直径 2 cm),如组织块小可适量加 OCT 包埋剂浸没组织,然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内,当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾,此时小盒保持原位切勿浸入液氮内,大约 10-20 秒组织即迅速冰冻成块。取出组织冰块立即置入 -80℃ 冰箱储存备用,或置于恒冷切片机冰冻切片。
冰冻切片 4~8 mm,冰冻切片后如不染色,必须吹干,储存低温冰箱内,或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。
室温放置 30 分钟后,入 4℃ 丙酮固定 10 分钟。也可根据需要选择其它的固定方式。
PBS 洗,5 分钟 × 3。
用 3% 过氧化氢孵育 5~10 分钟,消除内源性过氧化物酶的活性。
PBS 洗,5 分钟 × 3。
下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤(滴加一抗开始)。
二、石蜡切片免疫组化染色步骤
(一)三步法(以 SP 试剂盒为例)
1. 石蜡切片脱蜡至水。
2. 蒸馏水冲洗,PBS 浸泡 5 分钟,如需采用抗原修复,可在此步后进行。
3. 3% H2O2室温孵育 5~10 分钟,以消除内源性过氧化物酶的活性,PBS 冲洗,2 分钟× 3 次。
4. 5~10% 正常山羊血清封闭,室温孵育 10 分钟。倾去血清,勿洗,滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液,37℃ 孵育 1~2 小时或 4℃ 过夜。
5. PBS 冲洗,2 分钟× 3 次。
6. 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗(1% BSA-PBS 稀释),37℃ 孵育 10~30 分钟;或滴加第二代生物素标记二抗工作液,37℃ 或室温孵育 10~20 分钟。
7. PBS 冲洗,2 分钟× 3 次。
8. 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS 稀释),37℃ 孵育 10~30 分钟;或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液,37℃ 或室温孵育 10~20 分钟。
9. PBS 冲洗,2 分钟× 3 次。
10. 显色剂显色(DAB 或 AEC)。
11. 自来水充分冲洗,复染,脱水透明(如需要)、封片。
(二)二步法(以 PV-9000 通用型二步法检测试剂盒为例)
1. 石蜡切片脱蜡至水。
2. 蒸馏水冲洗,PBS 浸泡 5 分钟,如需采用抗原修复,可在此步后进行。
3. 3% H2O2 室温孵育 5~10 分钟,以消除内源性过氧化物酶的活性,PBS 冲洗,2 分钟 × 3 次。
4. 滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液,37℃ 孵育 1~2 小时或 4℃ 过夜。
5. PBS 冲洗,2 分钟×3 次。
6. 滴加试剂 1(Polymer Helper),室温或 37℃ 孵育 20 分钟,PBS 或TBS 冲洗,2 分钟×3 次。
7. 滴加试剂 2(poly peroxidase-anti-mouse/rabbit IgG),室温或 37℃ 孵育 20~30 分钟,PBS 或 TBS 冲洗,2 分钟× 3 次。
8. PBS 冲洗,2 分钟× 3 次。
9. 显色剂显色(DAB 或 AEC)。
10. 自来水充分冲洗,复染,脱水透明(如需要)、封片。