从外周血淋巴细胞中提取RNA
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实验试剂
1. Ficoll(Amersham Biosciences)
3. 裂解缓冲液:5mol/L单巯基氰酸胍,10mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),50mmol/L Tris—HCl,1mmol/L二硫苏糖醇(DTT),用0.45微孔滤膜过滤
5. RNA溶解缓冲液:0.1%SDS,lmmol/L EDTA,10mmol/LTris—HCl,pH 7.5,高压灭菌
6. 3mol/L乙酸钠,pH 4.8,焦碳酸二乙酯 (DEPC) 处理 (加0.2ml DEPC/100ml溶液)并灭菌
实验设备
实验步骤
3.在50ml塑料离心管中收集外周血淋巴细胞,并加入7ml裂解缓冲液(可溶解达到5×108 个外周血淋巴细胞),然后剧烈涡旋振荡以溶解细胞。
4.加入7体积(49m1)4mol/L氯化锂,4℃孵育15~20小时(过夜)。
5.将悬液转移到30mlCorex管内,在吊桶式转头内4℃离心2小时,6500r/min。
6.弃去上清,并用Kimwipe擦拭试管口。用3mol/L氯化锂(大约15ml)重悬,收集沉淀.将沉淀重悬液离心,6500r/min 1小时。
7.弃去上清,用2m1RNA溶解液溶解沉淀。在-20℃下,彻底冷冻悬液。