HLA基因分型方法：RFLP法
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RFLP 法
1 ）常规制备 DNA
盐析法
1． 用淋巴细胞分离液从抗凝血中分离出白细胞。
2． 每 3ml 细胞悬液加 10ml 红细胞裂解液溶解红细胞两次，再加 2ml 白细胞裂解液溶解白细胞。
3． 加 50 μ l 10 ％ SDS 和 70 μ l 蛋白酶 K 消化蛋白质， 37 ℃过夜或 55 ℃ 3h 。
4． 加 0.25 体积饱和醋酸钠溶液，剧烈摇动 15s 。
5． 2000r/min 离心 15min ，收集上清。
6． 加入 2.5 倍预冷无水乙醇沉淀 DNA ，－ 20 ℃过夜。
7． 吸取 DNA 团块用 70 ％乙醇洗 3 次，每次 10 000r/min ， 10min 。再溶于适量 TE 缓冲液中， 4 ℃保存。
酚抽提法
1． 采集 EDTA 抗凝血 0.5ml ，加双蒸水 2.5ml ，溶解红细胞。
2． 离心 10 000r/min ， 5min ，弃上清。
3． 加 0.5ml 生理盐水，混匀，离心 10 000r/min ， 5min ，弃上清。
4． 加 500 μ l TES ，混匀，再加 20 ％ SDS 25 μ l ，蛋白酶 K 4 μ l 置 55 ℃水浴 4h 或 37 ℃水浴过夜。
5． 加等体积饱和酚，混匀，离心 10 000r/min ， 5min ，吸取上层水相，再加等体积饱和酚抽提一次。
6． 加等体积氯仿：异戊醇再抽提一次。
7． 吸取上层液，加 1/10 体积醋酸钠， 2.5 倍体积无水乙醇，混匀，－ 20 ℃过夜，沉淀 DNA 。
8． 吸出 DNA 团块，用预冷 70 ％乙醇洗 1 次，弃尽液体，真空抽干 DNA ，加适量 TE 溶解。 4 ℃保存。
2 ）限制性内切酶消化
在无菌 EP 管中依次加入双蒸去离子水 7 μ l ， 10 ×缓冲液 2 μ l ，限制性内切酶 1 μ l ， DNA 10 μ l 。反应体系含 1 ×缓冲液、 DNA 5 μ g 、酶 10U 。稍离心以混匀， 37 ℃水浴 1 ～ 1.5h 。酶解结束后向反应管中加 1/10 体积的终止液终止反应，冷却至 4 ℃，准备电泳。
3 ）琼脂糖凝胶电泳
1． 配制 1 ％琼脂糖凝胶板：取 0.4g 琼脂糖加 40ml TBE ，微波炉熔化，加少量双蒸水补充蒸发的水分，将其冷却至 60 ℃，倒入凝胶槽内，充分凝固后拔出样品梳。
2． 从制胶槽中卸下凝胶板，放入电泳槽，加入 1 × TBE ，使其液面略高于琼脂糖板。
3． DNA 样品按 4 ： 1 的比例加样液，全部加样于琼脂糖板的样品孔中。
4． 电泳 80V ，约 2h 。
5． 取出凝胶板，置溴化乙锭溶液中染色 30min 。
6． 紫外灯下观察结果，可用全色黑白胶卷拍照，镜头加红色滤色镜，光圈 2 ，速度 15 ～ 40s 。
4 ）分子杂交
DNA 转移
1． 将琼脂糖凝胶切下，放入盛有变性液的搪瓷盘中，浸泡 15 ～ 20min ，用蒸馏水洗涤 2 ～ 3 次，用中和液再浸泡 15 ～ 20min 。
2． 取一托盘放入 10 × SSC 缓冲液，托盘上放一转移用支架，支架上搭滤纸桥，使溶液能够虹吸上来。
3． 在支架上依次放入 Whatman 3MM 滤纸，处理好的凝胶，硝酸纤维素膜， Whatman 3MM 滤纸，吸水纸，玻璃板，适量重物 500 ～ 1000g 。
4． 放 4 ℃冰箱转移 12 ～ 16h ，中间更换吸水纸。转移结束后，去除上面的东西，用镊子将膜取出，用清水冲洗一下后，让膜自然晾干。
5． 80 ℃真空干燥 2h ，将 DNA 固定于膜上，保存于干燥处待用。
预杂交液
将转移好的硝酸纤维素膜用 2 × SSC 溶液浸透，装入可加热封口的杂交袋中，按 0.2ml/cm2 加入适量预杂交液，用塑料热封口机封口。于 37 ～ 42 ℃ 预杂交 4 ～ 6h 。
杂交
1． 将塑料袋剪一小口，取出预杂交液。
2． 将标记好的探针加热变性，煮沸 7min ，骤冷至 0 ℃，加入杂交液。
3． 将含探针的杂交液加入袋中，封口。
4． 42 ℃水浴杂交 20h ，取出杂交液。
洗膜
1． 1 × SSC ， 0.1 ％ SDS 室温 15min × 2 。
2． 0.25 × SSC ， 0.1 ％ SDS 室温 15min × 2 。
放射自显影
1． 洗涤后的膜置于干净的滤纸上，室温自然晾干。
2． 用塑料薄膜包好膜，做好标记。
3． 在暗室内将 2 张 X 线胶片放在增感屏的内侧，并将硝酸纤维素膜放在 2 张 X 线胶片之间。
4． 盖严暗盒，放－ 50 ℃冰箱放射自显影 2 ～ 7 天。
5． 在显影液中显影 2 ～ 4min 。
6． 在定影液中定影 20min 。
7． 用清水洗胶片 20min ，晾干，读片检测结果。
