材料与仪器
PCR 引物 氯化镁溶液 dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP 混合液 Taq 聚合酶 96孔板 PCR热循环仪 琼脂糖 EB 溶液 上样缓冲液 电泳缓冲液 Long Ranger™ 凝胶溶液 尿素
水平凝胶电泳装置 紫外透射反射仪 滤膜 GS-400 HD ROX ABI 377 自动测序仪
步骤
一、端粒卫星的 PCR 扩增
1.将引物置于冰上融化后轻轻混匀,稍离心。
2.对于每个标记物,准备 12 个反应的混合液包括:196μL 高压蒸馏水、32.5 μL 10XPCR 缓冲液、9.75μL 氯化酶、32.5μLdNTP 混合物、正反向引物各 2uL 和 1U Taq 酶,在冰上操作和保存。
3.将上述 15uL PCR 反应混合液加到 10uL DNA 中,用铝箔胶盖密封 96 孔板。
4.扩增前将 96 孔板放到热循环仪上,94°C 变性 5 min。
5.循环条件为 94°C、30s,55°C、30s 和 72°C、45s,共进行 35 个循环,最后的延伸时间为 72°C、7 min。样品可在- 20°C 保存备用。
二、PCR 鉴定
1.凝胶电泳:取 3uL 上样缓冲液与 5uL PCR产物混合,上样到含有 5mg/ml EB 用 1XTBE 配制的 1.5% 琼脂糖凝胶上。
2.使用合适的分子质量标准,在 100V 电压下电泳 30min。
3.将电泳后凝胶移到紫外透射反射仪上观察 DNA,确保微卫星的正确扩增。
三、扩增产物的凝胶分析
1.按照 ABI 自动测序仪手册所列方法,把玻璃板和隔板放到指定的盒子里。
2.将 3 mL LongRanger 凝胶溶液和 3 mL10X TBE 混勻,加10.8 g 尿素,溶解后加去离子水至 30 mL,用 0.45um 滤膜过滤。
3.加入 150μL ,10% 的 APS 和 21μLTEMED 后倒胶,使凝胶聚合 lh。
4.按说明书将凝胶盒装进测序仪。
5.按表 2 所示在 PCR 扩增后将等量的每种扩增产物混合在一起(见注释 3)。
6.新鲜配制上样混合液:0.5μLGS-400 HDROX、1xL 上样缓冲液和 5 ml 去离子甲酰胺。
7.将 2μLPCR 产物混合溶液与 3pL 上样混合液混匀。
8.90°C 变性 3 min 后,快速放到冰上。
9.将样点人胶孔中。
10.应用运行 GS36D2400 模块搜集数据。
11.按产品手册说明用 GeneScan 软件进行数据分析。
12.用 GenoTyper 软件确定等位基因的大小。
注释
1.研究表明:细胞遗传学难以辨认的非平衡易位是导致 CT 地中海贫血智力障碍综合征(ATR-16[16])、Wolf-Hirchhorn 综合征 [17]、Miller-Diecker 综合征 [18] 和猫叫综合征(cri-du-chatsyndrome)[19] 智力障碍的原因。
2.用此方法可能会出现的问题是如何确定端粒重排导致的表型。当有一个以上的受累子代、端粒重排与智力障碍共分离时这种关系是明确的。在缺乏智力障碍家族史的条件下,当重排涉及以前智力障碍病例缺失的区域,或者当缺失片段非常大时,就可获得端粒重排的生物学效应证据。在其他病例中,确定小端粒重排的致病性可能更加艰难。
3.为了使获得的所有位点峰高一致,可能需要调整每次混合的比率。
来源:丁香实验