HLA基因分型方法:PCR-SSO(ASO)探针法
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PCR - SSO ( ASO )探针法
1 )常规提取 DNA
参见 RFLP 法
2 ) PCR 扩增
参见 PCR-RFLP 法
3 )斑点杂交
1. 将 5 ~ 20 μ l 扩增产物,加变性液 100 ~ 200 μ l 室温处理 5 ~ 15min 。
2. 在尼龙滤膜(预先用 2 × SSC 浸湿 2min )上真空点样,每孔以 10 × SSPE 200 μ l 冲洗,抽干, 80 ℃干燥 2h 。
3. 标记探针,取标记缓冲液 2.5 μ l ,寡核苷酸片段( dCTP, dGTP, dTTP ) 50 ~ 100ng , [ γ -32 P]ATP 2.5 μ l , T4 多核苷酸酶 10U ,双蒸水加至 25 μ l ,混匀, 37 ℃保温 45min ,用 0.5mol/L EDTA 1 μ l 终止反应,标记的探针可直接使用或采用柱层析分离标记好的探针。
4. 点样膜于杂交前漂洗,放入杂交袋中,加入适量预杂交液 2ml/10cm2 在杂交温度下预杂交 10 ~ 60min ,将适量标记探针加入预杂交液中,杂交 1h ~过夜。
5. 洗膜, 2 × SSPE 和 0.1 % SDS 于杂交温度洗 2 次,最后根据探针的 Tm 值调整洗膜 2 次。
6. - 70 ℃放射自显影,用保鲜膜包好杂交膜,放入暗盒,加增感屏,再放置 X 线片,置低温冰箱,感光时间须摸索。