夹心法ELISA检测人α2a,α2b干扰素(α2a,α2b)

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　　重组人α2a/α2b干扰素(rHuIFN-α2a、rHuIFN-α2b)生产流程中不可缺少的一环是产品的质量监控，通常采用的是HEp-2/VSV或Wish/VSV系统检测干扰素的生物活性。此系统常由于VSV或细胞的影响而不够稳定，且检测周期较长。我们用自制的2种针对rHuIFN-α2a和rHuIFN-α2b的单克隆 抗体(McAb)建立了定量检测rHuIFN-α2a和rHuIFN-α2b的双McAb夹心ELISA，敏感性达60pg/ml，结果与生物学活性检测相对应。试用于rHuIFN-α2a生产中的质量控制取得了满意的结果。此试剂盒也能检测人体产生的天然α干扰素，有用于基础和临床疾病研究的潜力。
　　一、原理：选用2种针对rHuIFN-α2a和rHuIFN-α2b分子 不同表位的McAb，1种McAb作为包被抗体，另1种McAb标记辣根过氧化物酶(HRP)作为结合物，催化底物显色。根据标准品OD值绘制标准曲线，在标准曲线上查出待检标本的含量。
　　二、试剂盒提供试剂(供检测22份标本)
　　1. 包被抗体：应用时用0.05M,pH9..6碳酸盐缓冲液作100倍稀释。
　　2. 酶标抗体：应用时用0.1％BSA-PBS 作200倍稀释(售出前已稀释10倍)。
　　3. 标准品：rHuIFN-α2a(3ng/ml)，用时用0.1％BSA-PBS作倍比稀释。
　　4. ABTS底物：ABTS 1mg＋0.1M,pH5.0柠檬酸缓冲液 2ml+3％ H２O２4μl(临用时配)。
　　三、自备试剂和材料
　　1. 进口96孔或国产40孔聚苯乙烯ELISA板(敏感性以进口板稍好)。
　　2. 0.1M,pH7.4 PBS配其它液体用。
　　3. 包被缓冲液：0.05M,pH9.6 Na２CO３-NaHCO３缓冲液。
　　4. 洗涤液：0.05％Tween 20-PBS。
　　5. 结合物稀释液：0.1％BSA-PBS(用于稀释标本、标准品和结合物)。
　　6. 底物缓冲液：0.1M,pH5.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。
　　7. ELISA读数仪等。

　　四、操作步骤
　　　向ELISA板中加入稀释好的包被抗体100μl/孔
　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 4℃ 24～48h
　　　　洗3次，加入10倍连续稀释的待测标本
　　　　(做4个稀释度即可)或倍比稀释的标准品(6个稀释度) 100μl/孔
　　　　　　　　　　　　　　　　↓37℃,1h
　　　　 洗3次，加入稀释好的酶标抗体100μl/孔
　　　　　　　　　　　　　　　　↓37℃,45min
　　　　洗4次，加入配好的ABTS底物液 100μl/孔
　　　　　　　　　　　　　　　　↓RT,30min
　　　　　　　　　　　　　测410nm OD
　　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　　　　　绘标准曲线

五、注意事项：
　　1. 待检标本必须无污染，无溶血。
　　2. 标本稀释后加入ELISA板时，注意从低浓度向高浓度依次加入。
　　3. 结合物稀释液和底物缓冲液中禁止加入叠氮钠。