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夹心法ELISA检测人干扰素(α2a,α2b)

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重组人α2a/α2b干扰素(rHuIFN-α2a、rHuIFN-α2b)生产流程中不可缺少的一环是产品的质量监控,通常采用的是HEp-2/VSV或Wish/VSV系统检测干扰素的生物活性。此系统常由于VSV或细胞的影响而不够稳定,且检测周期较长。

我们用自制的2种针对rHuIFN-α2a和rHuIFN-α2b的单克隆抗体(McAb)建立了定量检测rHuIFN-α2a和rHuIFN-α2b的双McAb夹心ELISA,敏感性达60pg/ml,结果与生物学活性检测相对应。试用于rHuIFN-α2a生产中的质量控制取得了满意的结果。

此试剂盒也能检测人体产生的天然α干扰素,有用于基础和临床疾病研究的潜力。

一、原理

选用2种针对rHuIFN-α2a和rHuIFN-α2b分子不同表位的McAb,1种McAb作为包被抗体,另1种McAb标记辣根过氧化物酶(HRP)作为结合物,催化底物显色。根据标准品OD值绘制标准曲线,在标准曲线上查出待检标本的含量。

二、试剂盒提供试剂(供检测22份标本)

1、包被抗体:应用时用0.05M,pH9.。6碳酸盐缓冲液作100倍稀释。

2、 酶标抗体:应用时用0.1%BSA-PBS作200倍稀释(售出前已稀释10倍)。

3、 标准品:rHuIFN-α2a(3ng/ml),用时用0.1%BSA-PBS作倍比稀释。

4、ABTS底物:ABTS 1mg+0.1M,pH5.0柠檬酸缓冲液 2ml 3% H2O24μl(临用时配)。

三、自备试剂和材料

1、 进口96孔或国产40孔聚苯乙烯ELISA板(敏感性以进口板稍好)。

2、0.1M,pH7.4 PBS配其它液体用。

3、 包被缓冲液:0.05M,pH9.6 Na2CO3-NaHCO3缓冲液。

4、 洗涤液:0.05%Tween 20-PBS.

5、结合物稀释液:0.1%BSA-PBS(用于稀释标本、标准品和结合物)。

6、底物缓冲液:0.1M,pH5.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。

7、ELISA读数仪等。

四、操作步骤

向ELISA板中加入稀释好的包被抗体100μl/孔

4℃ 24~48h

洗3次,加入10倍连续稀释的待测标本

(做4个稀释度即可)或倍比稀释的标准品(6个稀释度) 100μl/孔

↓37℃,1h

洗3次,加入稀释好的酶标抗体100μl/孔

↓37℃,45min

洗4次,加入配好的ABTS底物液 100μl/孔

↓RT,30min

测410nm OD

绘标准曲线

五、注意事项

1、 待检标本必须无污染,无溶血。

2、标本稀释后加入ELISA板时,注意从低浓度向高浓度依次加入。

3、结合物稀释液和底物缓冲液中禁止加入叠氮钠。

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