细胞凋亡检测：流式细胞仪检测技术

细胞调亡的流式细胞仪检测技术

一、固定细胞的染色方法

1 ） PI 单染色法

方法一

1． 收集细胞（ 1 ～ 5 ）× 10⁶ 个， 500 ～ 1000r/min 离心 5min ，弃去培养液。

2． 3ml PBS 洗一次。

3． 离心去 PBS ，加入冰预冷的 70 ％的乙醇固定， 4 ℃， 1h 。

4． 离心弃去固定液， 3ml PBS 重悬 5min 。

5． 400 目的筛网过滤 1 次， 500 ～ 1000r/min 离心 5min ，弃去 PBS 。

6． 用 1ml PI 染液， 4 ℃避光 30min 。

7． 流式细胞仪检测： PI 用氩离子激发荧光，激发光波波长为 488nm ，发射光波波长大于 630nm ，产生红色荧光，可分析前散射光对侧散射光的散点图及 PI 荧光的直方图。

方法二

1． 收集细胞（ 1 × 10⁶ 个）， 500 ～ 1000r/min 离心 5min ，弃去培养液。

2． 1ml PBS/FCS 洗一次。

3． 500 ～ 1000r/min 离心 5min 去 PBS/FCS ，加入 500 μ l PBS/FCS 和 500 μ l 的多聚甲醛固定液，轻轻混匀，在 4 ℃下固定 4min 。

4． 500 ～ 1000r/min 离心 5min 弃去固定液，室温加入含 0.2 ％ Tween 的 PBS 1ml ， 37 ℃孵育 15min 。

5． 1ml PBS/FCS 洗 3 次，每次 5min 。

6． 400 目的筛网过滤 1 次。

7． 500 ～ 1000r/min 离心 5min 去 PBS/FCS ，用 1.0ml PI 染液， 4 ℃避光至少 30min 。染色在 24h 之内皆可行，流式细胞仪分析。

2 ）调亡细胞的 TUNEL 的流式细胞仪分析

1． 离心收集细胞， PBS 洗 1 ～ 2 次。

2． 1 ％多聚甲醛低温下固定 15min 。

3． 3ml PBS 洗 1 次， 70 ％乙醇固定，冰箱内放置 1 ～ 3 天。

4． PBS 轻洗 1 次

5． 细胞与 TdT 标记液 37 ℃孵育，时间 1 ～ 2h 。

6． PBS 轻洗 1 次。

7． 细胞在黑暗中 37 ℃与 100 μ l 的染色缓冲液孵育 30min 。

8． 含 0.1 ％ Triton-X 100 的 PBS 轻洗 1 次。

9． 1ml PBS （含 5mg/ml PI, 0.1% RNase A ）重悬。

10． 流式细胞仪分析红色（ PI ）对绿色荧光（ FITC ）的地形图。

3 ） ISNT 的流式细胞仪分析

1． 离心收集细胞， PBS 洗 1 ～ 2 次

2． 1 ％多聚甲醛低温下固定 15min 。

3． 3ml PBS 洗 1 次， 70 ％乙醇固定，冰箱内放置 1 ～ 3 天。

4． PBS 轻洗 1 次。

5． 2 × 10⁵ 细胞与 12.5 μ l 的缺口平移缓冲液在 15 ℃共孵育 6h ，每过 15min 振动 1 次。

6． PBS 轻洗 1 次。

7． 细胞在黑暗中 37 ℃与 100 μ l 的染色缓冲液孵育 30min 。

8． 含 0.1 ％ Triton-X 100 的 PBS 轻洗 1 次。

9． 1ml PBS （含 5mg/ml PI, 0.1% RNase A ）重悬。

10． 流式细胞仪分析红色（ PI ）对绿色荧光（ FITC ）的地形图。

二、非固定细胞的染色方法

1 ） Hoechst 33342/PI 双染色法

1． 悬浮生长的细胞在培养状态下加入 Heochst 33342 ，终浓度为 1 μ g/ml ；帖壁生长的细胞用含有 0.02 ％ EDTA 的 0.25 ％胰蛋白酶消化成单细胞悬液，离心，弃上清，用 1ml 全培养液重悬细胞，加入 Heochst 33342 ，终浓度为 1 μ g/ml ， 37 ℃孵育 7 ～ 10min 。

2． 4 ℃ 500 ～ 1000r/min 离心弃去染液。

3． 加入 1.0ml PI 染液， 4 ℃避光染色 15min 。

4． 400 目的筛网过滤 1 次。

5． 流式细胞仪分析。

2 ） Annexin V/PI 双染色法

1． 细胞收集：悬浮细胞直接收集 10ml 的离心管中，而帖壁细胞先用滴管轻轻吹打，调亡细胞一经吹打可能脱壁，收集到 10ml 的离心管中，没脱壁的细胞用 0.02 ％的 EDTA 消化使之脱壁，每样本细胞数为（ 1 ～ 5 ）× 10⁶ ， 500 ～ 1000r/min 离心 5min 弃去培养液。

2． 用孵育缓冲液洗 1 次， 500 ～ 1000r/min 离心 5min 。

3． 用 100 μ l 的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育 10 ～ 15min 。

4． 500 ～ 1000r/min 离心 5min 沉淀细胞，孵育缓冲液洗 1 次。

5． 加入荧光溶液 4 ℃下孵育 20min ，避光并不时振动。