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细胞凋亡检测:流式细胞仪检测技术

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细胞调亡的流式细胞仪检测技术

 

一、固定细胞的染色方法

 

1 PI 单染色法

 

方法一

1. 收集细胞( 1 5 )× 106 个, 500 1000r/min 离心 5min ,弃去培养液。

2. 3ml PBS 洗一次。

3. 离心去 PBS ,加入冰预冷的 70 %的乙醇固定, 4 ℃, 1h

4. 离心弃去固定液, 3ml PBS 重悬 5min

5. 400 目的筛网过滤 1 次, 500 1000r/min 离心 5min ,弃去 PBS

6. 1ml PI 染液, 4 ℃避光 30min

7. 流式细胞仪检测: PI 用氩离子激发荧光,激发光波波长为 488nm ,发射光波波长大于 630nm ,产生红色荧光,可分析前散射光对侧散射光的散点图及 PI 荧光的直方图。

 

 

方法二

1. 收集细胞( 1 × 106 个), 500 1000r/min 离心 5min ,弃去培养液。

2. 1ml PBS/FCS 洗一次。

3. 500 1000r/min 离心 5min PBS/FCS ,加入 500 μ l PBS/FCS 500 μ l 的多聚甲醛固定液,轻轻混匀,在 4 ℃下固定 4min

4. 500 1000r/min 离心 5min 弃去固定液,室温加入含 0.2 Tween PBS 1ml 37 ℃孵育 15min

5. 1ml PBS/FCS 3 次,每次 5min

6. 400 目的筛网过滤 1 次。

7. 500 1000r/min 离心 5min PBS/FCS ,用 1.0ml PI 染液, 4 ℃避光至少 30min 。染色在 24h 之内皆可行,流式细胞仪分析。

 

 

2 )调亡细胞的 TUNEL 的流式细胞仪分析

 

1. 离心收集细胞, PBS 1 2 次。

2. 1 %多聚甲醛低温下固定 15min

3. 3ml PBS 1 次, 70 %乙醇固定,冰箱内放置 1 3 天。

4. PBS 轻洗 1

5. 细胞与 TdT 标记液 37 ℃孵育,时间 1 2h

6. PBS 轻洗 1 次。

7. 细胞在黑暗中 37 ℃与 100 μ l 的染色缓冲液孵育 30min

8. 0.1 Triton-X 100 PBS 轻洗 1 次。

9. 1ml PBS (含 5mg/ml PI, 0.1% RNase A )重悬。

10.  流式细胞仪分析红色( PI )对绿色荧光( FITC )的地形图。

 

 

3 ISNT 的流式细胞仪分析

 

1. 离心收集细胞, PBS 1 2

2. 1 %多聚甲醛低温下固定 15min

3. 3ml PBS 1 次, 70 %乙醇固定,冰箱内放置 1 3 天。

4. PBS 轻洗 1 次。

5. 2 × 105 细胞与 12.5 μ l 的缺口平移缓冲液在 15 ℃共孵育 6h ,每过 15min 振动 1 次。

6. PBS 轻洗 1 次。

7. 细胞在黑暗中 37 ℃与 100 μ l 的染色缓冲液孵育 30min

8. 0.1 Triton-X 100 PBS 轻洗 1 次。

9. 1ml PBS (含 5mg/ml PI, 0.1% RNase A )重悬。

10.  流式细胞仪分析红色( PI )对绿色荧光( FITC )的地形图。

 

 

二、非固定细胞的染色方法

 

1 Hoechst 33342/PI 双染色法

 

1. 悬浮生长的细胞在培养状态下加入 Heochst 33342 ,终浓度为 1 μ g/ml ;帖壁生长的细胞用含有 0.02 EDTA 0.25 %胰蛋白酶消化成单细胞悬液,离心,弃上清,用 1ml 全培养液重悬细胞,加入 Heochst 33342 ,终浓度为 1 μ g/ml 37 ℃孵育 7 10min

2. 4 500 1000r/min 离心弃去染液。

3. 加入 1.0ml PI 染液, 4 ℃避光染色 15min

4. 400 目的筛网过滤 1 次。

5. 流式细胞仪分析。

 

 

2 Annexin V/PI 双染色法

 

1. 细胞收集:悬浮细胞直接收集 10ml 的离心管中,而帖壁细胞先用滴管轻轻吹打,调亡细胞一经吹打可能脱壁,收集到 10ml 的离心管中,没脱壁的细胞用 0.02 %的 EDTA 消化使之脱壁,每样本细胞数为( 1 5 )× 106 500 1000r/min 离心 5min 弃去培养液。

2. 用孵育缓冲液洗 1 次, 500 1000r/min 离心 5min

3. 100 μ l 的标记溶液重悬细胞,室温下避光孵育 10 15min

4. 500 1000r/min 离心 5min 沉淀细胞,孵育缓冲液洗 1 次。

5. 加入荧光溶液 4 ℃下孵育 20min ,避光并不时振动。

 

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