细胞凋亡检测:流式细胞仪检测技术
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细胞调亡的流式细胞仪检测技术
一、固定细胞的染色方法
1 ) PI 单染色法
方法一
1. 收集细胞( 1 ~ 5 )× 106 个, 500 ~ 1000r/min 离心 5min ,弃去培养液。
2. 3ml PBS 洗一次。
3. 离心去 PBS ,加入冰预冷的 70 %的乙醇固定, 4 ℃, 1h 。
4. 离心弃去固定液, 3ml PBS 重悬 5min 。
5. 400 目的筛网过滤 1 次, 500 ~ 1000r/min 离心 5min ,弃去 PBS 。
6. 用 1ml PI 染液, 4 ℃避光 30min 。
7. 流式细胞仪检测: PI 用氩离子激发荧光,激发光波波长为 488nm ,发射光波波长大于 630nm ,产生红色荧光,可分析前散射光对侧散射光的散点图及 PI 荧光的直方图。
方法二
1. 收集细胞( 1 × 106 个), 500 ~ 1000r/min 离心 5min ,弃去培养液。
2. 1ml PBS/FCS 洗一次。
3. 500 ~ 1000r/min 离心 5min 去 PBS/FCS ,加入 500 μ l PBS/FCS 和 500 μ l 的多聚甲醛固定液,轻轻混匀,在 4 ℃下固定 4min 。
4. 500 ~ 1000r/min 离心 5min 弃去固定液,室温加入含 0.2 % Tween 的 PBS 1ml , 37 ℃孵育 15min 。
5. 1ml PBS/FCS 洗 3 次,每次 5min 。
6. 400 目的筛网过滤 1 次。
7. 500 ~ 1000r/min 离心 5min 去 PBS/FCS ,用 1.0ml PI 染液, 4 ℃避光至少 30min 。染色在 24h 之内皆可行,流式细胞仪分析。
2 )调亡细胞的 TUNEL 的流式细胞仪分析
1. 离心收集细胞, PBS 洗 1 ~ 2 次。
2. 1 %多聚甲醛低温下固定 15min 。
3. 3ml PBS 洗 1 次, 70 %乙醇固定,冰箱内放置 1 ~ 3 天。
4. PBS 轻洗 1 次
5. 细胞与 TdT 标记液 37 ℃孵育,时间 1 ~ 2h 。
6. PBS 轻洗 1 次。
7. 细胞在黑暗中 37 ℃与 100 μ l 的染色缓冲液孵育 30min 。
8. 含 0.1 % Triton-X 100 的 PBS 轻洗 1 次。
9. 1ml PBS (含 5mg/ml PI, 0.1% RNase A )重悬。
10. 流式细胞仪分析红色( PI )对绿色荧光( FITC )的地形图。
3 ) ISNT 的流式细胞仪分析
1. 离心收集细胞, PBS 洗 1 ~ 2 次
2. 1 %多聚甲醛低温下固定 15min 。
3. 3ml PBS 洗 1 次, 70 %乙醇固定,冰箱内放置 1 ~ 3 天。
4. PBS 轻洗 1 次。
5. 2 × 105 细胞与 12.5 μ l 的缺口平移缓冲液在 15 ℃共孵育 6h ,每过 15min 振动 1 次。
6. PBS 轻洗 1 次。
7. 细胞在黑暗中 37 ℃与 100 μ l 的染色缓冲液孵育 30min 。
8. 含 0.1 % Triton-X 100 的 PBS 轻洗 1 次。
9. 1ml PBS (含 5mg/ml PI, 0.1% RNase A )重悬。
10. 流式细胞仪分析红色( PI )对绿色荧光( FITC )的地形图。
二、非固定细胞的染色方法
1 ) Hoechst 33342/PI 双染色法
1. 悬浮生长的细胞在培养状态下加入 Heochst 33342 ,终浓度为 1 μ g/ml ;帖壁生长的细胞用含有 0.02 % EDTA 的 0.25 %胰蛋白酶消化成单细胞悬液,离心,弃上清,用 1ml 全培养液重悬细胞,加入 Heochst 33342 ,终浓度为 1 μ g/ml , 37 ℃孵育 7 ~ 10min 。
2. 4 ℃ 500 ~ 1000r/min 离心弃去染液。
3. 加入 1.0ml PI 染液, 4 ℃避光染色 15min 。
4. 400 目的筛网过滤 1 次。
5. 流式细胞仪分析。
2 ) Annexin V/PI 双染色法
1. 细胞收集:悬浮细胞直接收集 10ml 的离心管中,而帖壁细胞先用滴管轻轻吹打,调亡细胞一经吹打可能脱壁,收集到 10ml 的离心管中,没脱壁的细胞用 0.02 %的 EDTA 消化使之脱壁,每样本细胞数为( 1 ~ 5 )× 106 , 500 ~ 1000r/min 离心 5min 弃去培养液。
2. 用孵育缓冲液洗 1 次, 500 ~ 1000r/min 离心 5min 。
3. 用 100 μ l 的标记溶液重悬细胞,室温下避光孵育 10 ~ 15min 。
4. 500 ~ 1000r/min 离心 5min 沉淀细胞,孵育缓冲液洗 1 次。
5. 加入荧光溶液 4 ℃下孵育 20min ,避光并不时振动。