细胞凋亡检测-流式细胞仪检测技术

 

一、固定细胞的染色方法
1）PI单染色法
方法一
1．收集细胞（1～5）×106个，500～1000r/min离心5min，弃去培养液。
2．3ml PBS洗一次。
3．离心去PBS，加入冰预冷的70％的乙醇固定，4℃，1h。
4．离心弃去固定液，3ml PBS重悬5min。
5．400目的筛网过滤1次，500～1000r/min离心5min，弃去PBS。
6．用1ml PI染液，4℃避光30min。
7．流式细胞仪检测：PI用氩离子激发荧光，激发光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光，可分析前散射光对侧散射光的散点图及PI荧光的直方图。

方法二
1．收集细胞（1×106个），500～1000r/min离心5min，弃去培养液。
2．1ml PBS/FCS洗一次。
3．500～1000r/min离心5min去PBS/FCS，加入500μl PBS/FCS和500μl的多聚甲醛固定液，轻轻混匀，在4℃下固定4min。
4．500～1000r/min离心5min弃去固定液，室温加入含0.2％ Tween的PBS 1ml，37℃孵育15min。
5．1ml PBS/FCS洗3次，每次5min。
6．400目的筛网过滤1次。
7．500～1000r/min离心5min去PBS/FCS，用1.0ml PI染液，4℃避光至少30min。染色在24h之内皆可行，流式细胞仪分析。

2）调亡细胞的TUNEL的流式细胞仪分析
1．离心收集细胞，PBS洗1～2次。
2．1％多聚甲醛低温下固定15min。
3．3ml PBS洗1次，70％乙醇固定，冰箱内放置1～3天。
4．PBS轻洗1次
5．细胞与TdT标记液37℃孵育，时间1～2h。
6．PBS轻洗1次。
7．细胞在黑暗中37℃与100μl的染色缓冲液孵育30min。
8．含0.1％ Triton-X 100的PBS轻洗1次。
4．500～1000r/min离心5min弃去固定液，室温加入含0.2％ Tween的PBS 1ml，37℃孵育15min。
5．1ml PBS/FCS洗3次，每次5min。
6．400目的筛网过滤1次。
7．500～1000r/min离心5min去PBS/FCS，用1.0ml PI染液，4℃避光至少30min。染色在24h之内皆可行，流式细胞仪分析。

 

 

2）调亡细胞的TUNEL的流式细胞仪分析
1．离心收集细胞，PBS洗1～2次。
2．1％多聚甲醛低温下固定15min。
3．3ml PBS洗1次，70％乙醇固定，冰箱内放置1～3天。
4．PBS轻洗1次
5．细胞与TdT标记液37℃孵育，时间1～2h。
6．PBS轻洗1次。
7．细胞在黑暗中37℃与100μl的染色缓冲液孵育30min。
8．含0.1％ Triton-X 100的PBS轻洗1次。
9．1ml PBS（含5mg/ml PI, 0.1% RNase A）重悬。
10． 流式细胞仪分析红色（PI）对绿色荧光（FITC）的地形图。

3）ISNT的流式细胞仪分析
1．离心收集细胞，PBS洗1～2次
2．1％多聚甲醛低温下固定15min。
3．3ml PBS洗1次，70％乙醇固定，冰箱内放置1～3天。
4．PBS轻洗1次。
5．2×105细胞与12.5μl的缺口平移缓冲液在15℃共孵育6h，每过15min振动1次。
6．PBS轻洗1次。
7．细胞在黑暗中37℃与100μl的染色缓冲液孵育30min。
8．含0.1％ Triton-X 100的PBS轻洗1次。
9．1ml PBS（含5mg/ml PI, 0.1% RNase A）重悬。
10． 流式细胞仪分析红色（PI）对绿色荧光（FITC）的地形图。

二、非固定细胞的染色方法
1）Hoechst 33342/PI双染色法
1．悬浮生长的细胞在培养状态下加入Heochst 33342，终浓度为1μg/ml；帖壁生长的细胞用含有0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶消化成单细胞悬液，离心，弃上清，用1ml全培养液重悬细胞，加入Heochst 33342，终浓度为1μg/ml，37℃孵育7～10min。
2．4℃ 500～1000r/min离心弃去染液。
3．加入1.0ml PI染液，4℃避光染色15min。
4．400目的筛网过滤1次。
5．流式细胞仪分析。

2）Annexin V/PI双染色法
1．细胞收集：悬浮细胞直接收集10ml的离心管中，而帖壁细胞先用滴管轻轻吹打，调亡细胞一经吹打可能脱壁，收集到10ml的离心管中，没脱壁的细胞用0.02％的EDTA消化使之脱壁，每样本细胞数为（1～5）×106，500～1000r/min离心5min弃去培养液。
2．用孵育缓冲液洗1次，500～1000r/min离心5min。
3．用100μl的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10～15min。
4．500～1000r/min离心5min沉淀细胞，孵育缓冲液洗1次。
5．加入荧光溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动。