流式细胞仪检测细胞周期

流式细胞仪（flow cytometer，FCM）又称荧光激活细胞分类仪（fluorescence activited cell sortor，FACS），由光学系统、电子控制系统以及计算机分析系统三个部分组成。

流式细胞仪细胞生物学、免疫学、肿瘤生物学、病理学以及临床诊断中得到广泛应用。

器材：

① 移液器

② 枪头

③ 离心管

④ 离心机

⑤ 流式细胞仪

⑥ 水浴锅

试剂：

① 0.25% 胰蛋白酶溶液

② PBS

③ RNA 酶

④ PI 染液

⑤ 70% 乙醇溶液

⑥ PI 染液：15 mg Pl；枸橼酸钠 0.1 g；NP-40, 0.3 ml；加蒸馏水至 100 ml。

流式细胞仪检测细胞周期的基本过程可分为如下几步：

A. 取培养细胞 1 瓶，用胰蛋白酶消化，取 2×10⁵～1×10⁶/L 个细胞，用 PBS 制备成细胞悬液。

B. 1000 g 离心 10 min，弃上清液。加入 -20 °C 预冷的 70% 乙醇固定液重悬细胞，固定 30 min。

C. 轻弹管壁使沉淀松散，1000 g 离心 10 min 后，用 PBS 离心洗涤 2 次。

D. 离心后，用 RNA 酶消化细胞，室温 30 min。

E. 重复步骤 C。

F. 用 PI 染料避光孵育细胞 30 min。

G. 同步骤 C 用 PBS 洗涤细胞。如果不能立即上机检测，可以 4 °C 冰箱保存待测，最好在 5 h 之内或者当天内完成检测。

H. 选择最低上样速度，在流式细胞仪 488 nm 激发波长下检测红色荧光。

1. PI 为致癌物质，避免用手直接接触。

2. 细胞数目应该达到 2x10⁴ 个，细胞数目过少影响实验结果的准确性。

3. 在制备时，离心次数不宜过多，防止细胞丢失。

4. 以正常淋巴细胞调试流式细胞仪。