通过分析CDK的活性检测细胞周期

通过分析CDK的活性检测细胞周期的基本原理是细胞周期的特定时期可以根据下述的细胞周期蛋白-CDK复合物存在和活化来鉴定：细胞周期蛋白E-CDK2活性出现于晚G1期，消失于早S期。

细胞周期蛋白A-CDK2活性出现于早S期，消失于早M期；某些细胞类型中，细胞周期蛋白A-CDK1活性出现于G2期，消失于早M期；细胞周期蛋白B-CDK1活性出现于G2期，消失于中M期。

器材：

1 ml注射器和21 G针头，预冷到4 ℃

1.5 ml微型离心管，预冷到4 ℃；1 ml吸头，预冷到4℃

磷酸纤维素单位膜（Pierce）或1.5 c㎡的磷酸纤维素P81滤纸（What-man）；微型离心机；翻滚式旋转器或旋转轮

Whatman 3 MM滤纸；磷屏成像仪。

试剂：

①冰冷的1xPBS：NaCl,8.0 g;KCI,0.2 g;Na₂HPO₄·12H₂O,2.9 g;KH₂PO₄,0.2 g;

双蒸水定容至1000 ml。高压消毒（通常在1.034x105 Pa下灭菌30 min）

②冰冷的裂解缓冲液：30 ml 5 mol／L NaCl（终浓度0.15 mol／L）；12 ml 0.5 mol／L Na2 HPO1；8ml NaH₂PO₄；10 ml 0.5 mol／L EDTA（终浓度5.0 mmol／L）；10 ml NP-40（终浓度1.0％，体 积分数）。

10 g脱氧胆酸钠（终浓度为10 g／L）；1g SDS（终浓度为10 g／L）；2.1 g NaF（终浓度50.0 mmol／L）；1.8 g NaVO1（终浓度1.0 mmol／L）；10 ml抑肽酶（终浓度1.0％，体积分数）；928 ml 双蒸水。用0.45 μm孔径的膜进行过滤，4 ℃保存1个月。

③蛋白 A-Sepharose或蛋白 G-Sepharose（Amersham Pharmacia Biotech）偶联的、或甲醛处理的金黄色葡萄球菌（Pansorbin，Cal-biochem）。

④抗细胞周期蛋白抗体，抗CDK抗体或Cks-Sepharose 珠偶联物（Upstate Bio-technology）。

⑤冰冷的激酶缓冲液：250 μl 1mol／L Tris-HCl，pH7.5（终浓度 25 mmol／L）；300 μl5mol／L NaCl（终浓度150 mmol／L）；100 μl 1mol／L MgCl₂（终浓度10 mmol／L）；100 μl0.1ol／L二硫苏糖醇（DTT，终浓度1 mmol／L）。分装保存在-20 ℃可达半年。

⑥组蛋白H1溶液或一致的cdc2肽段（New England Biola-bs）：溶液 10 mg／ml小牛胸腺组蛋白H：（Boehringer Mannheim）；10 mmol／L Na₃PO₄，pH7.2；分装保存在-20℃可达1年。

⑦1 mmol／L ATP（100 mmol／L ATP用蒸馏水稀释）：1g ATP加入12 ml水，用1 mol／L NaOH调节到pH7.0，然后用水补足体积到16.7 ml。分装保存在-20 ℃可达1年。

⑧2000Ci／mmol［γ-33P］ATP或 3000Ci／mmol［γ-32P］ATP。

⑨100 mmol／L EDTA。

⑩2XSDS样品缓冲液。

⑪PKA抑制性肽段；50 mmol／L roscovitine或100 mmol／L抑霉素（olomoucine）（Calbiochem）的DMSO溶液（两种溶液都分装保存在-20 ℃可达1年，只溶解1次；抑霉素避光保存）：1 mmol／L肽（溶于10 mmol／L磷酸钠，pH7.2），-20 ℃可保存达1年。

⑫免疫沉淀下来的免疫前血清或抗IgG抗体（阴性对照）。

⑬纯化的细胞周期蛋白B-CDK1（阳性对照）。

⑭75 mmol／L磷酸。

⑮96％ 乙醇。

⑯15％ ～20％ SDS聚丙烯酰胺凝胶。

⑰考马斯亮蓝G250染液：5g／L考马斯亮蓝G-250；30％（体积分数）甲醇；10％（体积分数）乙酸。

通过分析CDK的活性检测细胞周期的基本过程可分为如下几步：

A. 将含有细胞的6 cm组织培养皿置于冰上的玻璃盘上，最好是在冷室中。用巴斯德吸管吸去培养基，加入3 ml冰冷PBS，维持在冰上1 min。倾斜培养皿，用巴斯德吸管除去PBS。用冰冷PBS重复洗涤，通过引流，小心地从培养皿中取出尽量多的PBS。

B. 加入1ml裂解缓冲液，将培养皿置冰上20 min。倾斜培养皿，用橡皮刮铲或细胞刮刀将裂解物刮到一边。

C. 用装有预冷21 G针头的预冷1ml注射器吸出裂解液，转移到一个预冷的1.5 ml微型离心管中。用针头吹吸裂解物3次以剪切DNA。也可以对离心管进行超声，注意始终维持裂解物冰冷状态。

D. 裂解液中加入10 μl蛋白 A-Sepharose 或蛋白G-Sepharose 偶联的、或甲醛处理的金黄色葡萄球菌细胞。盖上盖子，10000 g、4 ℃离心20 min净化裂解液。用预冷的1ml吸头取出裂解液（约900 μl），小心不要扰动沉淀。如果需要，裂解液冷冻并保存于-80 ℃；仅溶解1次，不要再次冰冻。

E. 将裂解液（约900μl）加入冰上装有适量的抗细胞周期蛋白抗体、抗CDK抗体（或Cks-Sepharose珠）的预冷的1.5ml微型离心管中，4 ℃孵育1h或过夜，在翻转式旋转器或旋转轮（用于Cks-Sepharose珠）上不停地混合。

F. 10000 g，4 ℃离心5 min。裂解液转移到一个新的、装有30～50 μl50％ 蛋白A-Seph-arose或蛋白G-Sepharose（悬于冰冷裂解缓冲液中）混合物的预冷1.5 ml微型离心管中。在翻转式旋转器或旋转轮上4 ℃混合30～45 min。

H. 去除上清液，沉淀中加入1ml冰冷激酶缓冲液，10000 g，4 ℃离心5 min。若用于SDS-PAGE分析，则将最后一次洗涤液中的Sepharose珠子转移到一个螺旋盖式微型离心管中。

I. 准备激酶分析混合物 80 μl激酶缓冲液，4 μl1 mmol／L ATP（终浓度40 μmol／L），4 μl 10 μCi／μl［y-33P］ATP（2000 Ci／mmol）或［y-32P］ATP（3000 Ci／mmol），0.5 μl 10 mg／ ml组蛋白H1（终浓度50 μg／ml），9.5 μl双蒸水。

J. 从沉淀中尽可能多地去除最后的洗涤液，但不能使沉淀完全变干。向冰上的免疫沉淀或Cks-Sepharose珠子中加入20μl激酶分析混合物，30 ℃孵育30 min。阴性对照免疫沉淀和阳性对照中也加入20 μl激酶分析混合物。

①样品中加入100 μl 100 mmol／L EDTA停止反应。将磷酸纤维素单位膜装在架子上，用一个吸管将样品吸到磷酸纤维素单位膜上，小心吸管头不要触及膜面。也可以将样品点到放在玻璃皿中的1.5 c㎡的磷酸纤维素P81纸上。磷酸纤维素单位膜和P81纸带负电荷；因此，底物中必须含有一些带正电的残基（组蛋白H1或一致性cdc2肽段）。

③将磷酸纤维素单位膜或P81滤纸转移到闪烁管中，加入2～10 ml闪烁液，如果使用32P则在32P通道，如果用33P则在35S通道计数。

2、用SDS-PAGE分析

④将凝胶放在Whatman 3MM滤纸上，用塑料纸包裹，用凝胶干燥仪在80 ℃干燥凝胶1h。凝胶用磷屏成像仪或X光胶片曝光（磷酸化组蛋白H1通常可以用手持式β计数器在干胶上检测到。如果使用32P，将一块打有孔的铅屏盖在凝胶上，来估计单一泳道的放射性同位素量。如果使用33P，使用另一块X光胶片阻挡其他泳道的信号）。

2. 细胞周期蛋白和CDK的一些结构域在活性复合物中是被遮蔽的。针对CDK的保守部分PSTAIRE模体制备的抗体只能识别未结合的、没有活性的激酶，故其仅用于免疫印迹，而激酶分析时不能应用。同样，针对细胞周期蛋白的C末端制备的抗体也不能应用，因为它们常常只识别单体蛋白质。