细胞同步化实验

在细胞培养过程中，细胞多处于不同的细胞周期时相中。不同时相的细胞对药物干预存在不同的反应，会影响实验的重复性，因此需要制备细胞周期一致的细胞。

细胞同步化是解决该问题的好办法。细胞同步化的方法多样，包括温度休克法、短时间饥饿法、药物抑制法以及离心淘洗法等。不同处理使细胞停留在不同的分裂时相中，血清饥饿使细胞停留在G0和G1期；胸苷（thymidine）可使细胞阻滞于S期；有丝分裂摇落法使细胞停止在M期。

培养瓶；移液器；枪头；小烧杯；10 ml吸管橡皮头；超净工作台；CO₂孵育箱；倒置相差显微镜；离心机。

试剂：

一、血清饥饿法（将细胞周期阻滞在G0／G1）

A. 用0.25％ 胰蛋白酶消化对数生长期HeLa细胞，收集细胞，600g离心5 min，弃上清液。

B. 用37 ℃预温pH7.4的PBS或无血清培养基洗涤细胞2次，重悬于培养液中。培养液中血清浓度低于0.5％。

C. 在CO₂孵育箱中37 ℃、5％ CO₂以及饱和湿度的条件下，培养24～48 h。

二、胸苷法（诱导细胞停滞在G1／S期交界）

A. 添加含2 mmol／L胸苷的新鲜培养液于培养对数生长期HeLa细胞的培养瓶中。

B. 在CO₂孵育箱中37 ℃、5％ CO₂以及饱和湿度的条件下，培养12 h。

C. 弃去含有胸苷的培养液，用等量的完全培养液洗涤贴壁细胞2次。更换新鲜培养液，在37 ℃的CO₂孵育箱中孵育16 h。

D. 弃去培养液，再加入2 mmol／L胸苷的新鲜培养液，并孵育12～14 h。

三、有丝分裂摇落法（将细胞截获于M期）

A. 取覆盖瓶底（汇合度）达70％～80％ 的HeLa细胞1瓶，弃去原培养液，用无血清培养液冲洗。然后加入3 ml 0.1％ 胰蛋白酶消化5 min。轻扣培养瓶，使松动细胞游离下来。

B. 600 g离心5 min，并调整细胞浓度至2.5x10⁵个／ml，种入培养瓶，于37 ℃的CO₂孵育箱中孵育6 h。

C. 摇动培养瓶，弃去未贴壁的细胞，更换培养液2次。加入培养液继续培养10 h。

D. 在10 h结束，轻轻摇动或轻扣培养瓶，收集M期细胞，600 g离心5 min，并用培养液将细胞浓度调整到2.5x10⁵个／ml。

2. 有丝分裂摇落法必须注意胰蛋白酶的消化时间，过长的消化时间将引起其他周期的细胞数目增加。