细胞介导细胞毒作用检测法4：时间分辩荧光分析法
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时间分辩荧光分析法
1 ）铕荧光检测法
标记靶细胞
1． EuCl3 的制备：称取 58.08mg Eu2 O3 ，用少量 1N HCl 搅拌至溶解，再用 1N NaOH 调节 pH 至 4.0 。加双蒸水配成 33 ～ 100mmol/L 的保存液， 4 ℃保存备用。
2． 用预冷的标记液将靶细胞浓度调整到 5 × 106 /ml ，加 50 μ l 10mg/ml 硫酸葡聚糖，置冰浴中 20 分钟，其间摇晃数次。
3． 加入 30 μ l 100mmol/L CaCl2 溶液终止反应 5 分钟。
4． 用含 2mmol/L CaCl2 的 RPMI-1640 培养液洗涤细胞 5 次。用含 10 ％小牛血清的 RPMI-1640 培养液将靶细胞配成 5 × 104 /ml 。
检测方法
1． 在 96 孔圆底细胞培养板中加入靶细胞悬液，每孔加 100 μ l 。
2． 向各孔加 100 μ l 效应细胞，效应细胞与靶细胞的比例根据要求而定，通常为 5 ： 1 ～ 20 ： 1 。自然释放孔不加效应细胞只加 100 μ l 培养液，最大释放孔中加 100 μ l 0.5 ％ Triton X-100 。每个实验置三个复孔。
3． 置 37 ℃ 5 ％ CO2 的二氧化碳培养箱中培养 3 小时。
4． 从每孔吸出 20 μ l 上清液，对应加入另一块 96 孔酶标板中，向第二块板每孔加 200 μ l 增强液。室温中混合 5 分钟。在时间分辩荧光分析仪上测定各孔的荧光强度。同时做 EuCl3 的标准曲线：用 0.05mol/L pH7.0 柠檬酸缓冲液配制 10 倍梯度
5． 特异性杀伤活性计算： 杀伤活性（％）＝ [ （实验组荧光强度－自然释放组荧光强度） / （最大释放组荧光强度－自然释放组荧光强度） ] × 100 ％
2 ）用时间分辩荧光检测法同时检测 NK 细胞对三种靶细胞的细胞毒性
标记靶细胞
1． 取 107 靶细胞，用洗涤液（含 93mmol/L NaCl, 5mmol/L KCl 和 2mmol/L MgCl2 的 50mmol/L pH7.4 Hepes ，双蒸水配制）洗涤一次。小心吸去上清液，用 1ml 标记液（洗涤液中加 0.5mg/ml 磷酸葡聚糖和 0.06mmol/L Eu3+ 或 2mmol/L Sm3+ 或 0.2mol/L Tb3+ ，以及比镧系离子浓度高 5 倍的 DTPA ）悬浮细胞。将细胞悬液置冰上 20 分钟，每 3 分钟上下吹打 1 次。
2． 加入 2ml 终止液（洗涤液中加 2mmol/L CaCl2 和 10mmol/L 葡萄糖），终止标记反应并使细胞膜上的孔隙封闭。 5 分钟后用终止液洗涤 3 次，用细胞培养液洗涤 3 次，每次洗涤时离心 500 × g 10 分钟。
3． 用细胞培养液将细胞配成 1.2 × 105 /ml 或 5 × 104 /ml 备用。
NK 细胞毒试验
1． 取 96 孔圆底细胞培养板，每孔加 3 中标记靶细胞悬液各 0.033ml 和 0.1ml 不同浓度的 NK 细胞，使效靶比从 100 ： 1 到 6 ： 1 。自发释放对照中不加效应细胞，只加 0.1ml 细胞培养液。最大释放对照中不加效应细胞，加 0.1ml 1 ％ Triton X-100 。每种处理重复 3 孔。
2． 在 37 ℃ 5 ％ CO2 饱和水汽二氧化碳培养箱中培养 4 小时。
3． 离心 1 500 × g 10 分钟。每孔取 20 μ l 上清液对应转移到另一块 96 孔平底细胞培养板中。每孔加 200 μ l Delfia 增强液，用下表的条件测定 Eu3+ 和 Sm3 ＋ 的荧光强度。
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循环时间（ ms ） |
滞留时间（ ms ） |
计数时间（ ms ） |
发射波长（ nm ） |
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Eu3 ＋ |
1 |
0.4 |
0.4 |
613 |
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Sm3 ＋ |
1 |
0.05 |
0.1 |
643 |
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Tb3 ＋ |
2 |
0.5 |
1.4 |
545 |
4． 用下式计算特异性杀伤活性： 杀伤活性（％）＝ [ （实验组荧光强度－自然释放组荧光强度） / （最大释放组荧光强度－自然释放组荧光强度） ] × 100 ％
3 ）用荧光增强配体标记的靶细胞检测 CMC 活性
1． 标记靶细胞：在 1 × 106 /ml K562 细胞中加入 BA-TDA 到 10 μ mol/L ， 37 ℃标记 30 分钟。用洗涤液（ 137mmol/L NaCl ， 4.2mmol/L NaHCO3 ， 5mmol/L KCl ， 0.44mmol/L KH2 PO4 ， 1.2mmol/L TES pH7.4 ）洗涤细胞 5 次。用细胞培养液将细胞配成 5 × 104 /ml 。
2． 取 96 孔圆底细胞培养板，每孔加 0.1ml 标记靶细胞悬液和 0.1ml 不同浓度的 NK 细胞，使效靶比从 100 ： 1 到 6 ： 1 。自发释放对照中不加效应细胞，只加 0.1ml 细胞培养液；最大释放对照中不加效应细胞，加 0.1ml 1 ％ Triton X-100 。每种处理重复 3 孔。
3． 在 37 ℃ 5 ％ CO2 饱和水汽二氧化碳培养箱中培养 4 小时。
4． 离心 1500 × g 10 分钟。每孔取 20 μ l 上清液对应转移到另一块 96 孔平底细胞培养板中。第二块板每孔加 180 μ l Eu3 ＋ 溶液，摇晃 5 分钟后用时间分辩荧光分析仪检测荧光强度。计算杀伤活性。
