时间分辩荧光分析法
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）铕荧光检测法
标记靶细胞
1．EuCl 3 的制备：称取58.08mg Eu 2 O 3 ，用少量1N HCl搅拌至溶解，再用1N NaOH调节pH至4.0。加双蒸水配成33～100mmol/L的保存液，4℃保存备用。
2．用预冷的标记液将靶细胞浓度调整到5×10 6 /ml，加50μl 10mg/ml硫酸葡聚糖，置冰浴中20分钟，其间摇晃数次。
3．加入30μl 100mmol/L CaCl 2 溶液终止反应5分钟。
4．用含2mmol/L CaCl 2 的RPMI-1640培养液洗涤细胞5次。用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液将靶细胞配成5×10 4 /ml。
检测方法
1．在96孔圆底 细胞培养 板中加入靶细胞悬液，每孔加100μl。
2．向各孔加100μl效应细胞，效应细胞与靶细胞的比例根据要求而定，通常为5：1～20：1。自然释放孔不加效应细胞只加100μl培养液，最大释放孔中加100μl 0.5％ Triton X-100。每个实验置三个复孔。
3．置37℃ 5％ CO 2 的二氧化碳培养箱中培养3小时。
4．从每孔吸出20μl上清液，对应加入另一块96孔酶标板中，向第二块板每孔加200μl增强液。室温中混合5分钟。在时间分辩荧光分析仪上测定各孔的荧光强度。同时做EuCl 3 的标准曲线：用0.05mol/L pH7.0柠檬酸缓冲液配制10倍梯度
5．特异性杀伤活性计算：杀伤活性（％）＝[（实验组荧光强度－自然释放组荧光强度）/（最大释放组荧光强度－自然释放组荧光强度）]×100％
2 ）用时间分辩荧光检测法同时检测NK 细胞对三种靶细胞的细胞毒性
标记靶细胞
1．取10 7 靶细胞，用洗涤液（含93mmol/L NaCl, 5mmol/L KCl和2mmol/L MgCl 2 的50mmol/L pH7.4 Hepes，双蒸水配制）洗涤一次。小心吸去上清液，用1ml标记液（洗涤液中加0.5mg/ml磷酸葡聚糖和0.06mmol/L Eu 3+ 或2mmol/L Sm 3+ 或0.2mol/L Tb 3+ ，以及比镧系离子浓度高5倍的DTPA）悬浮细胞。将细胞悬液置冰上20分钟，每3分钟上下吹打1次。
2．加入2ml终止液（洗涤液中加2mmol/L CaCl 2 和10mmol/L葡萄糖），终止标记反应并使细胞膜上的孔隙封闭。5分钟后用终止液洗涤3次，用 细胞培养 液洗涤3次，每次洗涤时离心500×g 10分钟。
