时间分辩荧光分析法

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1 ）铕荧光检测法

标记靶细胞

1．EuCl3的制备：称取58.08mg Eu2O3，用少量1N HCl搅拌至溶解，再用1N NaOH调节pH至4.0。加双蒸水配成33～100mmol/L的保存液，4℃保存备用。

2．用预冷的标记液将靶细胞浓度调整到5×106/ml，加50μl 10mg/ml硫酸葡聚糖，置冰浴中20分钟，其间摇晃数次。

3．加入30μl 100mmol/L CaCl2溶液终止反应5分钟。

4．用含2mmol/L CaCl2的RPMI-1640 培养液洗涤细胞5次。用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液将靶细胞配成5×104/ml。

 

 

检测方法

1．在96孔圆底细胞培养 板中加入靶细胞悬液，每孔加100μl。

2．向各孔加100μl效应细胞，效应细胞与靶细胞的比例根据要求而定，通常为5：1～20：1。自然释放孔不加效应细胞只加100μl培养液，最大释放孔中加100μl 0.5％ Triton X-100。每个实验置三个复孔。

3．置37℃ 5％ CO2的二氧化碳培养箱中培养3小时。

4．从每孔吸出20μl上清液，对应加入另一块96孔酶标板中，向第二块板每孔加200μl增强液。室温中混合5分钟。在时间分辩荧光分析仪上测定各孔的荧光强度。同时做EuCl3的标准曲线：用0.05mol/L pH7.0柠檬酸缓冲液配制10倍梯度

5．特异性杀伤活性计算：杀伤活性（％）＝