农杆菌质粒DNA提取常规方法（不用试剂盒）

相关专题

成功走出第一步：DNA提取

一、从在含20 mg/l Kanamycin和15 mg/l Gentamycin 5-8 ml的液体LB培养基中接种Agrobacterium 细胞，然后在28℃、200-220 rpm培养24 h。然后进行质粒 提取。

二、新鲜配制Sol II溶液（880 µl H2O, 100 µl SDS 10%, 20 µl 10 N NaOH），及包含 4 mg/ml溶菌酶Lysozyme 的200 µl Sol I (P1)溶液。

三、对培养一昼夜的的Falcon试管在3600 rpm速度下进行离心12 min，丢弃上清。

四、用200 µl 5 M NaCl重悬农杆菌细胞，利用涡旋将农杆菌细胞混匀。转移到eppendorf 管中。

五、加入20 µl 10% N-Lauroylsarcosine sodium溶液，上下倒置6-8次混匀（从不同方向倒置）。

六、最大速度（13000 × g ）下离心2 min，丢掉上清液。

七、用200 µl含4 mg/ml Lysozyme的Sol I (P1)（Sol I: 50 mM glucose, 25 mM Tris-Cl (8.0), 10 M EDTA (8.0)）重悬沉淀，涡旋直至混匀。有时可用微量移液管头将其搅拌混匀。置于冰上。

八、加入400 µl Sol II (P2)（Sol II: 880 µl H2O, 100 µl SDS 10%, 20 µl 10 N NaOH），上下倒置6-8次混匀（从不同方向倒置）。在冰上放置5 min。

九、加入300 µl Sol III (P3)，用手振荡。在冰上放置10 min。Sol III = Buffer P3, Neutrilization solution.

十、最大速度（13000 × g ）下离心12 min。

十一、将上清液（700 µl）转移到新的eppendorf 管中。

十二、用1× 酚/氯仿（Phenol/Chloroforum，350 µl Phenol +350 µl Chlororum, “Choloforum” is 24 parts chloroforum and 1 part isoamylalcohol）抽提。在通风橱中，往eppendorf 管中加入酚和氯仿（氯仿加入时要动作迅速，否则会吸入微量移液器中）。涡旋15 s，最大速度（13000 × g ）下离心2 min。将上层相（700 µl）小心移入新的Eppendorf管中。倾斜吸取，防止吸入下层的酚/氯仿。注意所有使用过的吸头都放入通风橱内的有毒拉圾箱内。酚/氯仿残留液倒入通风橱下面柜子里的酚/氯仿废液瓶中。

十三、用700 µl isopropanel沉淀，室温下放置5 min。

十四、最大速度（13000 × g ）下离心15 min，小心除去上清。可分两步，先用大移液管移走大部分上清，剩余50 µl左右再离心5 min。注意沉淀小球并不一定牢固吸在管壁上，小心不要吸走沉淀。

十五、用70%酒精洗涤。加入1 ml 70%酒精，最大速度（13000 × g ）下离心5 min，小心移去上清。室温下晾干。

十六、20 µl TE + 10 mg/ml RNase A重悬沉淀。在冷室放置一昼夜，后贮于-20℃冰箱。