从农杆菌分离质粒
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一、从在含20 mg/l Kanamycin和15 mg/l Gentamycin 6 ml的液体LB培养基中接种Agrobacterium 细胞,然后在28℃、200-220 rpm培养24 h。准备进行质粒提取。
质粒提取前,检查裂解液(Lysis Solution)是否有沉淀,如果有,要在65℃下溶解。对试剂盒中的稀释溶液(Elution Solution)(用Qiagen公司的EB(5 mM Tris, pH 8.5)代替)置于65℃下预热。
二、对培养后的Falcon试管在3600 rpm速度下进行离心12 min,丢弃上清。
三、用200 µl 试剂盒中的重悬溶液(Resuspension Solution)对农杆菌沉淀小球进行混匀重悬(蜗旋或用微量移液管上下吹吸)。
四、加入200 µl裂解液(Lysis Solution),上下倒置6-8次混匀(从不同方向倒置),直到变混和液变清变粘为止。不要蜗旋,防止对DNA 剪切。裂解反应不要超过5 min(最后一个样加后计时2 min可也)。
五、加入350 µl 中和/结合溶液(Neutralization/Binding Solution),轻轻上下倒置4-6次混匀,然后在≥12000 × g 或最大速度下离心10 min。如果上清中还有大量的悬浮颗粒,须重新离心。
六、插入过滤柱(GenElute Miniprep Binding Column),在柱中加入500 µl 柱准备溶液(Column Preparation Solution),在12000 × g 转速成下离心30 至1 min。丢弃滤过液。
七、将第五步中的上清转移入柱中,在12000 × g 转速成下离心30 至1 min。丢弃滤过液。
八、在柱中加入500 µl 选择洗液(Optional Wash Solution),在12000 × g 转速成下离心30 至1 min。丢弃滤过液。
九、在柱中加入750 µl稀释后的洗液(Wash Solution),在12000 × g 转速成下离心30 至1 min,丢弃滤过液。然后在最大转速下离心1至2 min。注意:一定要在洗液2(Wash Solution 2)中加入乙醇。
十、将过滤下的洗液倒掉,再在最大转速下离心1至2 min,以彻底除去残留在洗液中的乙醇。
十一、在柱下装上新收集管,柱中加入100 µl 稀释溶液(Elution Solution)(用Qiagen公司的EB(5 mM Tris, pH 8.5)代替),在≥12000 × g 或最大速度下离心1 min。稀释液中的质粒DNA 或用或贮藏于-20℃.条件下。
十二、取10 µl质粒样品+3 µl载液(6 × DNA load dye)在1% 琼脂糖胶上跑电泳,鉴定质粒提取产量。