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质粒DNA提取技术

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2210

实验原理

 

实验试剂

 

实验设备

 

实验材料

 

实验步骤

 

1. 将25mL含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基加入100mL锥形瓶中,接入含R-pGEX-4T-1质粒的大肠杆菌,37℃振荡培养过夜。

2. 收菌,吸取1.5mL培养物加入1.5mL离心管中,4000r/min室温离心2min。

3. 吸去培养液,使细菌沉淀尽可能干燥。

4. 将细菌沉淀悬浮于100μL溶液Ⅰ中,充分混匀,室温放置10min。

5. 加入200μL溶液Ⅱ(新鲜配制),盖紧盖子,混匀内容物,将离心管放冰上5min。

6. 加入150μL溶液Ⅲ(冰上预冷),盖紧盖子,颠倒数次使混匀。冰上放置15min。

7. 12000r/min离心15min,将上清转至另一离心管中。

8. 向上清中加入等体积酚:氯仿(1:1)(去蛋白),反复混匀,12000r/min离心5min,将上清转至另一离心管中。

9. 向上清中加入2倍体积无水乙醇,混匀后,室温放置5~10min。

10. 12000r/min离心5min,倒去上清液,将离心管倒扣在吸水纸上,吸干液体。

11. 用1mL70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀,振荡,12000r/min离心5min,倒去上清液,空气干燥。

12. 加20μL纯水(含20μg/mL胰RNA酶),使质粒DNA完全溶解,-20℃保存。

     (注:1mL纯水中加2μL10mg/mL的胰RNA酶配制成溶解质粒的纯水。)

13. 在下次实验中观察实验结果,通过琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA。

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