质粒DNA提取技术

实验原理

 

实验试剂

 

实验设备

 

实验材料

 

实验步骤

 

1. 将25mL含氨苄青霉素（100μg/mL）的LB液体培养基加入100mL锥形瓶中，接入含R-pGEX-4T-1质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。

2. 收菌，吸取1.5mL培养物加入1.5mL离心管中，4000r/min室温离心2min。

3. 吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。

4. 将细菌沉淀悬浮于100μL溶液Ⅰ中，充分混匀，室温放置10min。

5. 加入200μL溶液Ⅱ(新鲜配制)，盖紧盖子，混匀内容物，将离心管放冰上5min。

6. 加入150μL溶液Ⅲ(冰上预冷)，盖紧盖子，颠倒数次使混匀。冰上放置15min。

7. 12000r/min离心15min，将上清转至另一离心管中。

8. 向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min离心5min，将上清转至另一离心管中。

9. 向上清中加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10min。

10. 12000r/min离心5min，倒去上清液，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。

11. 用1mL70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡，12000r/min离心5min，倒去上清液，空气干燥。

12. 加20μL纯水(含20μg/mL胰RNA酶)，使质粒DNA完全溶解，－20℃保存。

     （注：1mL纯水中加2μL10mg/mL的胰RNA酶配制成溶解质粒的纯水。）

13. 在下次实验中观察实验结果，通过琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA。