质粒DNA提取技术
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实验原理
实验试剂
实验设备
实验材料
实验步骤
1. 将25mL含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基加入100mL锥形瓶中,接入含R-pGEX-4T-1质粒的大肠杆菌,37℃振荡培养过夜。
2. 收菌,吸取1.5mL培养物加入1.5mL离心管中,4000r/min室温离心2min。
4. 将细菌沉淀悬浮于100μL溶液Ⅰ中,充分混匀,室温放置10min。
5. 加入200μL溶液Ⅱ(新鲜配制),盖紧盖子,混匀内容物,将离心管放冰上5min。
6. 加入150μL溶液Ⅲ(冰上预冷),盖紧盖子,颠倒数次使混匀。冰上放置15min。
7. 12000r/min离心15min,将上清转至另一离心管中。
8. 向上清中加入等体积酚:氯仿(1:1)(去蛋白),反复混匀,12000r/min离心5min,将上清转至另一离心管中。
9. 向上清中加入2倍体积无水乙醇,混匀后,室温放置5~10min。
10. 12000r/min离心5min,倒去上清液,将离心管倒扣在吸水纸上,吸干液体。
11. 用1mL70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀,振荡,12000r/min离心5min,倒去上清液,空气干燥。
12. 加20μL纯水(含20μg/mL胰RNA酶),使质粒DNA完全溶解,-20℃保存。