免疫球蛋白提取技术

随着免疫学的发展和需要，免疫球蛋白的纯化和其成分的提纯成为必不可少的手段。纯化的方法很多，有单一法，但大多数采用二步法以上相结合的方法，特别是以硫酸铵提纯为基础，再经过层析柱的方法来提高免疫球蛋白及其各成分的纯度最为常用。

硫酸铵溶液能使蛋白质胶体脱水并中和其电荷而使之沉淀下来（称为盐析）。不同浓度的硫酸铵盐析蛋白成分不同，利用这一原理提取所需的免疫球蛋白成分。盐析只能粗提，为了获得纯化的免疫球蛋白成分，必须进一步采用层析的方法进行分离。

免疫球蛋白包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。

1.取20ml血清，加生理盐水20ml，再逐滴加入（NH₄）₂SO₄饱和溶液10ml，使成20%（NH₄）₂SO₄溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置30min。

2.3000r/min离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白。

3.在上清液中再加（NH₄）₂SO₄饱和溶液30ml，使成50%（NH₄）₂SO₄溶液，充分混合，静置30min。

4.3000r/min离心20min，弃上清。

5.于沉淀中加20ml生理盐水，使之溶解，再加（NH₄）₂SO₄饱和溶液10ml，使成33%（NH₄）₂SO₄溶液，充分混合后，静置30min。

6.3000r/min离心20min，弃上清，以除去白蛋白。重复步骤5，2——3次。

7.10ml生理盐水溶解沉淀，装入透析袋。

8.除盐，在常水中透析过夜，再在生理盐水中于4℃透析24h，中间换液数次。

以1%BaCl₂检查透析液中的SO₄^2-或以纳氏试剂检查NH4 （取3——4ml透析液，加试剂1——2滴，出现砖红色即认为有NH4 存在），直至无SO₄^2-或NH4 出现为止。也可采用SephadexG25或电透析除盐。

9.离心去沉淀（去除杂蛋白），上清液即为粗提IgG （即γ球蛋白，如以36％的饱和硫酸铵沉淀血清的产物即为优球蛋白，Euglobin，含γ球蛋白）。

10.过DEAE——纤维素层析柱。（装柱过程见层析技术）。以0.01Mol/L pH7.4PBS（0.03Mol/L NaCl）洗脱，收集洗脱液。

也可采用SephadexG150或G200柱。

11.蛋白质及其定量鉴定。

12.IgG的纯度鉴定，可采用下列方法之一鉴定。

①玻片琼脂或醋酸纤维膜电泳均可

加样电泳后，只在γ—球蛋白的迁移部位出现一条带。操作时，同时可用全血清样品，不同浓度（NH4）2SO4盐析样品进行电泳，以资比较。

②琼脂双相双扩散鉴定

预先准备该IgG免疫异种动物所获的抗IgG血清。将IgG与抗IgG血清进行双相双扩散，如IgG提纯的话，则在两样品孔之间出现一条沉淀线。

③免疫电泳鉴定

孔内加待测样品，电泳后，在槽内加抗IgG血清，琼脂扩散24h，观察结果。如果提取的IgG纯的话，则只出现一条弧形的沉淀线，且沉淀线位于γ—球蛋白区。此鉴定必须同时进行全血清及抗血清抗体的免疫电泳，以资比较。

④圆盘电泳鉴定

用全血清样品及提纯样品同时进行圆盘电泳。全血清样品在圆盘电泳上出现数十条区带，而纯化的IgG则只有一条区带。

13.IgG的浓缩与保存

①IgG的浓缩

②IgG的保存

一般浓缩至1%以上的浓度，再分装成小瓶冻干保存，或加0.01%硫柳汞在普通冰箱或低温冰箱保存，注意防止反复冻融。

材料准备与试剂配制

1.动物血清

2.硫酸铵饱和溶液

硫酸铵800g~850g

H₂O 1000ml

加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28%NH₄OH调pH至7.0（不调pH值也可以）。

注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须除去重金属，可在溶液中通入H₂S，静置过夜后滤过，加热蒸发H2S即可。

3.0.01Mol/L pH7.4PBS液

A液：0.10Mol/L NaH₂PO₄液

NaH₂PO₄•；2H₂O 15.60g

加H2O至1000.ml

B液：0.10Mol/L Na₂HPO₄液

Na₂HPO₄•12H₂O  35.80g

加H2O至1 000ml

取A液19ml，B液81ml加水至1000ml即可。

4.1%BaCl₂溶液

5.纳氏液

HgI 115.00g

KI 80.00g

加H₂O至500.00ml

溶化后过滤，然后再加20%NaOH500.00ml，混合即可。

6.0.50 Mol/L的HCl液和0.50 Mol/L的NaOH液。

7.洗脱液：0.03Mol/L的NaCl液。

8.透析袋（或玻璃纸）。

应用硫酸铵盐析及DEAE-纤维素层析法提纯化的IgG，不仅操作复杂、需时较长，处理过程中样品体积大大增加，而且透析时变性严重，容易引起抗体效价降低等。为了克服这一不足，特别是当大量提取IgG时，则往往采取下列的简易办法。

1.DEAE-纤维素直接提取法

取样品直接过DEAE-纤维素柱。下面介绍的是最为简单的烧杯法。

①以一定数量的DEAE52放入烧杯中，加入0.01Mol/L pH8.0PBS缓冲液，静置30min，去上清细粒，再重复一次。

②用布氏漏斗（内放两层滤纸）过滤。

③以5g湿重的DEAE-纤维素加1ml血清及3ml蒸馏水混合液的比例，加入各成分，充分搅拌。

④于4℃中放置1h，中间搅拌数次。

⑤用布氏漏斗抽滤，再用0.01Mol/L pH8.0PB缓冲液冲洗纤维素，抽滤。滤液即为提取的IgG液。

2.DEAE——SephadexA——50为弱碱性阴离子交换剂，经NaOH将Cl-型转变为OH-型后，可吸附酸性蛋白，血清中除γ——G属中性蛋白外其余均属酸性蛋白。当溶液的pH在6.5时，酸性蛋白均被DEAE——SephadexA——50吸附，只有γ——G留在溶液中。因此利用这一原理可以提取γ——G。这种提取法流程大大缩短，纯化前后样品体积变化不大，而且所得γ——G无变性现象。经过四次处理，其纯度也较好。缺点是收集量少，损耗大。

①DEAE—SephadexA—50的处理。取DEAE——SephadexA——50若干克，悬浮于蒸馏水中，1h后倾去上层小颗粒，然后用0.50Mol/L NaOH处理1h，蒸馏水洗至中性，再用0.5 Mol/L HCl处理0.5h，水洗至中性，最后以0.01Mol/L pH6.5PB液平衡、抽干。

②取一定的血清量，加等量的0.01Mol/L pH6.5PB液，再加液体体积1/4的滤干的DEAE——SephadexA——50，混合、4℃放置1h，不时搅拌、抽滤、收集滤液。

③再用同样重量的DEAE——SephadexA——50处理滤液。反复处理三次。（全程共四次）。获得滤液即为γ——G制品。

④DEAE——SephadexA——50的回收。用0.5Mol/L的Na2HPO4洗脱，抽滤至滤液中无蛋白（OD280﹤0.04）后，再用蒸馏水洗至中性即可回收使用。