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免疫球蛋白提取技术

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免疫球蛋白(Immunoglobulin Ig)的含量代表着机体体液免疫的水平,并进一步代表着B细胞的功能,因此测定血清Ig含量可以推知机体的体液免疫功能和诊断某些疾病引起的Ig的过高和过低。

随着免疫学的发展和需要,免疫球蛋白的纯化和其成分的提纯成为必不可少的手段。纯化的方法很多,有单一法,但大多数采用二步法以上相结合的方法,特别是以硫酸铵提纯为基础,再经过层析柱的方法来提高免疫球蛋白及其各成分的纯度最为常用。

硫酸铵溶液能使蛋白质胶体脱水并中和其电荷而使之沉淀下来(称为盐析)。不同浓度的硫酸铵盐析蛋白成分不同,利用这一原理提取所需的免疫球蛋白成分。盐析只能粗提,为了获得纯化的免疫球蛋白成分,必须进一步采用层析的方法进行分离。

免疫球蛋白包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。

一、IgG的分离与提纯

1、材料与试剂配制

(1)动物血清

(2)硫酸铵饱和溶液

硫酸铵800g~850g

H2O 1000ml

加热至绝大部分溶质溶解为止,趁热过滤,置室温过夜,然后以28%NH4OH调pH至7.0(不调pH值也可以)。

注:硫酸铵以质量优者为佳,因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须除去重金属,可在溶液中通入H2S,静置过夜后滤过,加热蒸发H2S即可。

(3)0.01Mol/L pH7.4PBS液

A液:0.10Mol/L NaH2PO4液

NaH2PO4•;2H2O 15.60g

加H2O至1000.ml

B液:0.10Mol/L Na2HPO4液

Na2HPO4•;12H2O 35.80g

加H2O至1 000ml

取A液19ml,B液81ml加水至1000ml即可。

(4)1%BaCl2溶液

(5)纳氏液

HgI 115.00g

KI 80.00g

加H2O至500.00ml

溶化后过滤,然后再加20%NaOH500.00ml,混合即可。

(6)0.50 Mol/L的HCl液和0.50 Mol/L的NaOH液。

(7)洗脱液:0.03Mol/L的NaCl液。

(8)透析袋(或玻璃纸)。

2、操作方法

(1)取20ml血清,加生理盐水20ml,再逐滴加入(NH4)2SO4饱和溶液10ml,使成20%(NH4)2SO4溶液,边加边搅拌,充分混合后,静置30min。

(2)3000r/min离心20min,弃去沉淀,以除去纤维蛋白。

(3)在上清液中再加(NH4)2SO4饱和溶液30ml,使成50%(NH4)2SO4溶液,充分混合,静置30min。

(4)3000r/min离心20min,弃上清。

(5)于沉淀中加20ml生理盐水,使之溶解,再加(NH4)2SO4饱和溶液10ml,使成33%(NH4)2SO4溶液,充分混合后,静置30min。

(6)3000r/min离心20min,弃上清,以除去白蛋白。重复步骤5,2~3次。

(7)10ml生理盐水溶解沉淀,装入透析袋。

(8)除盐,在常水中透析过夜,再在生理盐水中于4℃透析24h,中间换液数次。

以1%BaCl2检查透析液中的SO42-或以纳氏试剂检查NH4 (取3~4ml透析液,加试剂1~2滴,出现砖红色即认为有NH4 存在),直至无SO42-或NH4 出现为止。也可采用SephadexG25或电透析除盐。

(9)离心去沉淀(去除杂蛋白),上清液即为粗提IgG (即γ球蛋白,如以36%的饱和硫酸铵沉淀血清的产物即为优球蛋白,Euglobin,含γ球蛋白)。

(10)过DEAE-纤维素层析柱。(装柱过程见层析技术)。以0.01Mol/L pH7.4PBS(0.03Mol/L NaCl)洗脱,收集洗脱液。
也可采用SephadexG150或G200柱。

(11)蛋白质及其定量鉴定。

(12)IgG的纯度鉴定,可采用下列方法之一鉴定。

①玻片琼脂或醋酸纤维膜电泳均可

加样电泳后,只在γ—球蛋白的迁移部位出现一条带。操作时,同时可用全血清样品,不同浓度(NH4)2SO4盐析样品进行电泳,以资比较。

②琼脂双相双扩散鉴定

预先准备该IgG免疫异种动物所获的抗IgG血清。将IgG与抗IgG血清进行双相双扩散,如IgG提纯的话,则在两样品孔之间出现一条沉淀线。

③免疫电泳鉴定

孔内加待测样品,电泳后,在槽内加抗IgG血清,琼脂扩散24h,观察结果。如果提取的IgG纯的话,则只出现一条弧形的沉淀线,且沉淀线位于γ—球蛋白区。此鉴定必须同时进行全血清及抗血清抗体的免疫电泳,以资比较。

④圆盘电泳鉴定

用全血清样品及提纯样品同时进行圆盘电泳。全血清样品在圆盘电泳上出现数十条区带,而纯化的IgG则只有一条区带。

(13)IgG的浓缩与保存

①IgG的浓缩

②IgG的保存

一般浓缩至1%以上的浓度,再分装成小瓶冻干保存,或加0.01%硫柳汞在普通冰箱或低温冰箱保存,注意防止反复冻融。

3、IgG的简易快速提取法

应用硫酸铵盐析及DEAE-纤维素层析法提纯化的IgG,不仅操作复杂、需时较长,处理过程中样品体积大大增加,而且透析时变性严重,容易引起抗体效价降低等。为了克服这一不足,特别是当大量提取IgG时,则往往采取下列的简易办法。

(1)DEAE-纤维素直接提取法

取样品直接过DEAE-纤维素柱。下面介绍的是最为简单的烧杯法。

①以一定数量的DEAE52放入烧杯中,加入0.01Mol/L pH8.0PBS缓冲液,静置30min,去上清细粒,再重复一次。

②用布氏漏斗(内放两层滤纸)过滤。

③以5g湿重的DEAE-纤维素加1ml血清及3ml蒸馏水混合液的比例,加入各成分,充分搅拌。

④于4℃中放置1h,中间搅拌数次。

⑤用布氏漏斗抽滤,再用0.01Mol/L pH8.0PB缓冲液冲洗纤维素,抽滤。滤液即为提取的IgG液。

(2)DEAE-SephadexA-50为弱碱性阴离子交换剂,经NaOH将Cl-型转变为OH-型后,可吸附酸性蛋白,血清中除γ-G属中性蛋白外其余均属酸性蛋白。当溶液的pH在6.5时,酸性蛋白均被DEAE-SephadexA-50吸附,只有γ-G留在溶液中。因此利用这一原理可以提取γ-G。这种提取法流程大大缩短,纯化前后样品体积变化不大,而且所得γ-G无变性现象。经过四次处理,其纯度也较好。缺点是收集量少,损耗大。

①DEAE—SephadexA—50的处理。取DEAE-SephadexA-50若干克,悬浮于蒸馏水中,1h后倾去上层小颗粒,然后用0.50Mol/L NaOH处理1h,蒸馏水洗至中性,再用0.5 Mol/L HCl处理0.5h,水洗至中性,最后以0.01Mol/L pH6.5PB液平衡、抽干。

②取一定的血清量,加等量的0.01Mol/L pH6.5PB液,再加液体体积1/4的滤干的DEAE-SephadexA-50,混合、4℃放置1h,不时搅拌、抽滤、收集滤液。

③再用同样重量的DEAE-SephadexA-50处理滤液。反复处理三次。(全程共四次)。获得滤液即为γ-G制品。

④DEAE-SephadexA-50的回收。用0.5Mol/L的Na2HPO4洗脱,抽滤至滤液中无蛋白(OD280﹤0.04)后,再用蒸馏水洗至中性即可回收使用。


4、禽血清IgG的分离与提纯(Na2SO4法)

(1)试剂

①5%葡聚糖硫酸盐

②0.02Mol/L MnCl2溶液

③无水硫酸钠

④pH8.2硼酸盐缓冲液

⑤0.06Mol/L pH7.4PB液

(2)操作方法

①取禽血清10ml加5%葡聚糖硫酸盐液,0.40ml和0.025Mol/L MnCl21.00ml充分混合,静置,然后离心去沉淀,此步目的是为了去掉脂类物质。

②于上清液中加无水硫酸钠使每毫升血清含0.18g,缓慢加入,混匀,静置30min,3 000r/min离心去上清。

③以pH8.2硼酸盐缓冲液将沉淀稀释至原血清的一半再加硫酸钠使成0.16g/ml,同上法离心去上清。

④重复步骤③,加Na2SO4,使成0.14g/ml。

⑤以少量硼酸盐缓冲液溶解沉淀,然后装透析袋除盐48h。

⑥过SephadexG200柱,收集第一峰和第二峰。第一峰是IgM,第二峰主要是IgG。

⑦如要进一步提纯,则用第二峰再过DEAE—纤维素柱,以0.06Mol/L pH7.4 PB液洗脱,洗脱下来的蛋白液即为IgG。

也可以按以下操作方法进行:

①以18%硫酸钠(W/V)提取一次,再以14%的硫酸钠提取一次。

②将粗提的免疫球蛋白以PBS溶解,按9%加入无水硫酸钠,离心。再将上清按5%加入无水硫酸钠,离心。将两沉淀溶解、混合,在常水中透析过夜,再在生理盐水中4℃透析,直至无SO42-为止。

③离心将上清液以pH8.0 0.20Mol/L PBS液平衡。

④过SephadexG200柱,以pH8.0 0.20Mol/L PBS液洗脱,收集洗脱液,取第二峰即为鸡IgG。

二、IgM的分离与提纯

1、材料

(1)血清

(2)葡聚糖凝胶G200

(3)洗脱液0.01Mol/L pH7.4PBS(0.14Mol/L NaCl或0.1Mol/L pH8.0 Tris-HCl 0.14Mol/L NaCl)

2、操作方法

选取2.50cm×90cm层析柱,用葡聚糖凝胶G200装柱,平衡后,直接加血清样品10ml或硫酸铵粗提制品,洗脱液洗脱,流速0.25ml/min,分管收集,测OD280值,第一峰即为IgM。将第一峰的数管混合,浓缩、鉴定。

三、IgA的分离与提纯

1、材料与试剂配制

(1)DEAE52纤维素

(2)0.10Mol/L ZnSO4

ZnSO4•;7H2O 2.88g

加水至1000.00ml

(3)饱和硫酸铵溶液

(4)10%EDTA—Na

(5)SephadexG200

(6)0.01Mol/L pH7.4PB液

(7)0.10Mol/L pH6.4PB液

(8)血清

2、操作方法

(1)取血清加等量的0.1Mol/L ZnSO4液,调pH至7.0,室温搅拌1h,离心去沉淀。

(2)于上清液中加入等量的饱和硫酸铵溶液,混匀后静置30min或冰箱过夜。

(3)10000r/min离心10min,去上清。

(4)取沉淀溶于4ml10%EDTA-Na溶液中。

(5)生理盐水中透析除盐。

(6)过DE52柱,用0.01Mol/L pH7.4PB液洗脱蛋白(IgG)弃去。

(7)换用0.1Mol/L pH6.4PB液洗脱,收集蛋白峰,即为IgA。

(8)再过SephadexG200柱,洗液为0.01Mol/L pH7.4PBS(0.14Mol/L NaCl),收集洗脱液测OD280值,取第一峰即为纯化IgA。

(9)透析、浓缩、鉴定。

四、分泌型IgA的分离与鉴定

1、材料与试剂

(1)初乳

(2)SephadexG200

(3)0.10Mol/L pH6.8PB液

(4)0.01Mol/L pH7.4PB液

(5)DEAE52

2、操作方法

(1)取初乳20ml,10 000rpm离心10min,弃去表面脂肪层及底部的沉淀物。

(2)取乳清过SephadexG200柱(柱规格为2.50cm×90cm),以0.10Mol/L pH6.8PB液洗脱,第一峰为IgA(含IgG)。

(3)收集乳液,于0.01Mol/L pH7.4PB液中透析。

(4)将透析液浓缩至5mg/ml以上。

(5)过DE52层析柱,用0.01Mol/L pH7.4PB液洗脱,洗下蛋白峰为IgG,弃去。

(6)换用0.10Mol/L pH6.8PB液或0.01Mol/L pH7.4PBS(0.10Mol/L NaCl)液洗脱,

收集洗脱液,即为较纯的IgA液。

(7)必要时,可再过一次SephadexG200柱。

(8)浓缩,鉴定

五、禽IgA提取与纯化

1、材料与试剂配制

(1)禽胆汁

(2)饱和硫酸铵溶液

(3)0.01Mol/L pH7.4PBS液

(4)0.10Mol/L pH6.4PBS液(0.30Mol/L NaCl)

(5)DEAE52-纤维素

2、操作方法

(1)取冷藏的胆汁3Ⅹml,缓慢滴加Ⅹml饱和硫酸铵液,边加边搅拌,使成25%饱和硫酸铵液。4℃放置30min。

(2)3000r/min离心30min,去沉淀。

(3)取上清,加饱和硫酸铵液,使成35%的饱和度,4℃放置30min。

(4)3000r/min离心30min,弃上清。

(5)取沉淀,加0.85%NaCl液溶解,加饱和硫酸铵溶液,重复步骤3和4三次。

(6)将沉淀用0.85%NaCl液溶解,装入透析袋,以0.01Mol/L pH7.4PBS液透析。

(7)以0.01Mol/L pH7.4PBS液平衡,过DEAE52纤维柱(20×250mm)。

(8)取透析样品4ml(﹥20mg/ml蛋白浓度)加入层析柱。以0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脱。

(9)再用0.10Mol/L pH6.4PBS液(NaCl浓度为0.30Mol/L)洗脱,收集洗脱液。

(10)浓缩洗脱蛋白液至20mg/ml,分装,低温冰箱保存。

六、IgE的分离与提纯

1、材料与试剂

(1)血清

(2)饱和硫酸铵溶液

(3)洗脱液0.005Mol/L pH7.4PB液

0.025 Mol/L pH7.4PB液

0.01Mol/L pH7.4PBS液(0.14mol/L NaCl)

(4)DE52

(5)SephadexG150

2、操作方法

(1)取血清倍比稀释后,加等量饱和(NH4)2SO4溶液,盐析。

(2)离心取沉淀,溶于少量生理盐水中,透析、除盐。

(3)过DE52柱,以0.005Mol/L pH7.4PB液洗脱,收集洗脱蛋白峰(IgG),弃去。

(4)换以0.025Mol/L pH7.4 PB液洗脱,洗下的蛋白峰主要是IgE。

(5)透析除盐。

(6)过G150柱,以0.01Mol/L pH7.4PBS(0.14Mol/L NaCl)洗脱,收集洗脱液即为纯化的IgE。

(7)浓缩、鉴定。

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