琼脂糖凝胶DNA片段回收中的常见问题

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DNA连接与转化

1、未回收到DNA片段或回收效率很低

A、原因：胶块未完全溶解

建议：为加快凝胶的溶解，应将凝胶置于55度水浴中溶解，期间不断上下颠倒，待确定凝胶完全溶解后再进行后续操作。每100 mg凝胶应加入100uL溶胶液，如果胶块过大，应将胶块切成小块，以便于凝胶溶解。

B、原因：加入溶胶液过少

建议：对于PCR 产物，或者酶切产物，应加入2倍体积的溶胶液。对于凝胶回收，每100 mg凝胶应加入不少于100uL溶胶液。对小于200bp的片段应加入5倍体积的溶胶液。

C、原因：DNA Wash Buffer 中未加入无水乙醇

建议：第一次使用前，按照说明书要求加入要求的无水乙醇。DNA Wash Buffer使用后，应旋紧瓶盖，以防乙醇挥发，漂洗时损失DNA，降低回收效率。

D、原因：洗脱缓冲液不合适

建议：洗脱液的pH值在7.0~8.5时，洗脱效率最高，洗脱液pH超出此范围，将会显著影响收获率，请使用试剂盒配套的Elution Buffer(pH 8.5，10mM Tris-HCl)，或者使用使用pH值在此范围的ddH2O。

E、原因：洗脱缓冲液未加到离心柱中间

建议：因为在洗脱时使用较少的洗脱缓冲液，洗脱缓冲液应加在中间位置，并室温放置1~2分钟，然后再离心洗脱。另外，采用65度预热的洗脱Buffer将显著提高回收效率。

F、原因：起始回收量太少

建议：如果起始回收量很好的样品，应富集，最好使用不少于1ug的样品。对于PCR产物，应事先电泳检测产量，在进行回收操作。

2、电泳时，产物漂出点样孔

原因：洗脱时，柱子中残留乙醇

建议：在进行洗脱前，如果柱子上残留乙醇，将会影响洗脱效率，在洗脱前应再次离心，或者空气中放置几分钟，再进行洗脱。

3、后续无法进行连接等实验操作

原因：洗脱液中含有乙醇

建议：洗脱前，确保柱子中乙醇已无残留乙醇。