改良多聚－L－赖氨酸防脱片载玻片的制备

改良多聚－L－赖氨酸防脱片载玻片的制备
徐婷　（海门市人民医院，226007）  鄂群  钟声旺  邱冬梅（南通大学）

摘要  目的：通过改良载玻片洗洁法防脱片处理并与传统防脱片法和市售成品防脱片进行比较，探索一种经济实用效果良好的防脱片载玻片的制备方法；方法：将市售普通载玻片进行改良防脱片载玻片的制备处理和传统重铬酸钾洗涤法及防脱片制备处理后，与市售防脱片载玻片成品进行相同的临床病理组织学切片制备；结果：改良防脱制备法效果稳定可靠明显优于传统防脱片处理法，并可与市售防脱片处理的成品载玻片媲美；结论：改良多聚－L－赖氨酸防脱片载玻片的制备法方便可靠，经济实用。

在生物及病理组织学切片制备，如石蜡切片、冰冻切片或细胞涂片及其常规染色中，组织掉片或脱片现象均普遍存在，特别在实验步骤较多的免疫组织化学染色及原位杂交时尤其严重，不认真对待就会对临床病理诊断工作造成困难，延误诊断时间，甚至漏诊误诊等不利影响。目前，在临床病理诊断中，特殊染色，免疫组化和原位杂交已成为常用的病理技术，所以，对在病理切片制备过程中存在组织掉片或脱片现象更应该采取严格措施，以预防脱片，降低脱片率。本文建立了一种多聚－L－赖氨酸防脱片载玻片的制备方法，其效果显著，使组织切片与载玻片脱离与成为罕见现象。现介绍如下，以供大家借鉴。

1. 材料与方法
1.1 材料　
1.1.1  洗涤用具：⑴毛巾，⑵电水壶，⑶塑料面盆及桶，⑷橡胶手套，⑸烧杯和玻璃棒。
1.1.2  主要试剂及耗材：⑴无水乙醇；⑵清洁液；⑶5％洗衣粉水溶液：先将电水壶盛水烧热倒入含有洗衣粉的塑料桶中，达至1：20左右比例，55～65℃即可;⑷多聚－L－赖氨酸防脱片工作液；1：10的多聚赖氨酸和双蒸水；（5）市售载玻片
1.2  方法：取市售普通载玻片分别用改良防脱片法制备1000张，传统重铬酸钾酸处理及防脱片制备法[1]（省略）500张
1.2.1  拆开市售普通载玻片包装，去除载玻片及其间的薄隔纸片；
1.2.2  将载玻片依次投入盛有水的塑料面盆中，使载玻片的表面与水充分接触；
1.2.3  将载玻片从水中捞出，投入盛有热的5％洗衣粉水溶液的塑料桶中，盖上闷热1 小时；
1.2.4  待5％洗衣粉水溶液的温度用手可触及时（40～45℃），用棉布条将载玻片逐一每片擦洗后再投入流水中清洗;
1.2.5　取出流水洗10分钟，沥干，入无水乙醇2～4小时；
1.2.6　取出直接投入清洁液过夜；
1.2.7　取出流水洗10分钟，略加翻动至残留清洁液由红褐色变成无色，
1.2.8　流水洗10分钟，再入3％洗衣粉洗涤；投入流水略翻动，
1.2.9　流水洗10分钟，再入蒸馏水二次，取出沥水凉干待涂胶;
1.2.10 载玻片的磨砂面向上，平放在干净的纸上或桌面，
1.2.11  在载玻片的表面滴加1：10的多聚赖氨酸，
1.2.12　用另一载玻片覆盖其上，呈夹心饼干式结构，；
1.2.13　过夜待自然干燥后;揭开上方的载玻片，并将其涂胶面朝上再放置2小时使充分凉干;
1.2.14　收集涂胶载玻片，用笔标记涂胶面并注意其涂胶面方向一致的收藏于盒中，，放置于阴凉，干燥处待用。
1.3    统计分析 采用SPSS统计软件进行统计分析。
                                 
2　　注意事项
2.1  玻片洗涤中应注意手的防护，戴好乳胶手套，以防热的碱性液体的伤害。
2.2　新鲜清洁液呈红褐色，频繁使用后呈绿褐，提示清洁液效力下降或失效。
2.3　配制清洁液加入浓硫酸时特别要注意安全，最好戴上眼镜、口罩待防护用品，预防意外事件的发生。
2.4、此法系单面涂胶，务必注意涂胶面的记号，漂片贴片时，将组织蜡膜贴敷于涂胶面。
2.5　在材料与方法的1.2.9步骤，当载玻片从水中被提起后，其整个清洁面上应该可见滞留的水膜存在（不洁区域则没有），否则为不合格，应毫不犹豫将其重新处理或剔除。
2.6　涂胶量的多少，以两张载玻片叠加时不溢出且无空泡为最佳。两载玻片清洁面的涂胶;主要是非磨砂面面对面重叠涂胶，呈握手状；即错开磨砂面（不需重叠不需涂胶）。
2.7  在冬季，气温低。流水步骤（1.2.9与1.2.9）后应加一道温水清洗程序，以利于洗洁液的彻底清除。
3  结果 
载玻片洁净程度及其防脱片剂的使用方式与病理切片组织的脱落程度显著相关。本文取普通市售载玻片1500 张制备的防脱片载玻片，其中改良方法1000 张，传统方法500张，并与市售涂有多聚赖氨酸的载玻片400张一同用于制作临床病理组织，并对脱片现象（组织10%甚至全部脱离载玻片的现象）进行记录和统计，结果见表一。
表一 三种载玻片应用中掉片率的比较
组别 脱片数 总数 脱片率（‰）
改良方法 20 1000 20.0a
传统方法 21 500 42.0b
方法undefined 7 400 17.5c
~undefined方法C为市售涂有多聚赖氨酸的载玻片
a，b：&chi;2=6.068 p<0.05；a，c：&chi;2=0.094 p>0.05

4、结论
改良方法与传统方法相比，差异有统计学意义，改良方法20.0‰的脱片率要优于传统方法42.0‰的掉片率；改良方法与市售防脱片载玻片相比，差异无统计学意义，即20‰脱片率的改良方法不比17.5‰脱片率的市售防脱片载玻片差。改良防脱制备法效果稳定可靠明显优于传统防脱片处理法，并可与市售防脱片处理的成品载玻片媲美。
5、讨论
石蜡组织切片制备过程，如切片的脱蜡，脱水，水洗和染色等实验操作中经常出现切片脱落现象是长期困扰组织学实验技术者及其科研人员的一个棘手问题。本文认为在实验操作中，组织质地、组织石蜡块制作的质量、切片及其染色过程的搅动及步骤多少等诸多组织切片脱片因素中，作为组织切片载体的载玻片是脱片因素中的最基本最关键因素之一，不可有任何疏忽。要制备优质的防脱片载玻片，必须正确理解并认真做好其中的每一步操作。
市售新的载玻片肉眼看似很干净，由于加工过程中难免其表面难免附着灰尘，杂质或油酯，必须处理后方可使用。显然，未经酸、碱洗涤的玻璃表面凹凸不平，其表面层的厚度和表面粗糙度大[3]。因此，本文认为;要较好地完成多聚－L－赖氨酸防脱片载玻片的制备，首先，要保证彻底清除待处理载玻片上的杂质、灰尘及其油脂。本文在清洁液酸处理前设置热的碱性洗涤液处理和无水酒精溶去脂步骤，目的是彻底清除杂质、灰尘和油酯及其混合物，尤其在冬季则更不能省略，其中热力和碱性袪污剂有除脂去污的双重作用，无水酒精起加强脱脂去脂的作用，通过碱洗,可消除酸洗难以去除的油脂类等形成的表面薄层,从而进一步降低了表面粗糙度，然后，再经酸处理的载玻片,由于去除了表面前处理残留的杂质及各种吸附污染物,从而使其表面粗糙度进一步明显降低;酸处理后的碱性洗涤可进一步消除可能残留的油酯，使玻璃表面的光学性能得到进一步改善,最终使玻璃表面层的杂质厚度下降到最小 [3]，这样，就为防脱片剂的涂胶即其与载玻片表面的零距离接触连接提供了可靠保证；其次，经热洗涤及无水酒精即清洁液处理前，和涂胶前蒸馏水清洗过程中，当载玻片从水中被提起后，其整个清洁面上应该可见滞留的水膜存在[2]，它们是检查洗涤处理否则合格的两处可用肉眼检查的指标，如两者中后一处（阶段）指标不合格，应毫不犹豫将其剔除或重新处理。因为，多聚－L－赖氨酸防脱片剂是水溶性的溶液，显而易见，载玻片上杂质油脂不去除干净，会成为载玻片表面与多聚－L－赖氨酸防脱片剂间的接触障碍，不然，是很难保证后继玻片涂胶质量。还要注意的是；化学清洗对提高玻璃表面的质量,诸如光洁度等,是相当有效的。但必须控制好酸碱度的大小及清洗时间,避免清洗过度影响玻璃表面的光学质量,以获得最佳效果。也不要轻易省略其后继的碱性液洗涤，因为，经过进一步的碱洗,可进一步保证对残留油脂的清除，使玻璃表面的光洁度和光学性能得到进一步改善。最后，本文采用了载玻片+多聚－L－赖氨酸+载玻片的夹心饼干式涂胶法，此法能使防脱片剂在载玻片有效贴片表面形成一种较长时间的潴留，十分有利于防脱片剂与干净载玻片有效贴片表面的紧密接触和延长其互相作用的时间，与经典浸泡式涂胶法相比，不但其操作方法简便易学，而且，既有效保证了涂胶质量又显著的节约了试剂，达到了市售防脱片载玻片优良防脱片的效果。
参考文献
[1]章丽霞.洗洁精法和重铬酸钾清洁液清洗载玻片方法的比较.中外医疗杂志[J], 2007，21：39
[2] 凌启波编著；实用病理特殊染色和组化技术, 1989年07月第1版，316-318
[3] 顾铮，梁培辉，张伟清；化学清洗对玻璃表面层光学特性的影响化学　中国激光, Chinese Journal of Lasers, 2004年 03期　367－370

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